МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 5, с. 698-707
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.42.017.73:577.211
К ВОПРОСУ ОБ АНАЭРОБНОМ ОКИСЛЕНИИ МЕТАНА
© 2004 г. В. Ф. Гальченко*
Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 26.09.03 г.
Проведены эксперименты с пробами черноморских анаэробных осадков и выделенными из них накопительными культурами, а также с аэробной метанокисляющей бактерией МеШуХотопа^ твШат-са, штамм 12, с целью выяснения биологической природы анаэробного метанокисления. Ингиби-торно-стимуляторный анализ не позволяет сделать однозначный вывод о прямом и независимом участии метанобразующих или сульфатредуцирующих микроорганизмов в биогеохимическом процессе анаэробного метанокисления. Накопительные культуры, выделенные из восстановленных осадков и водных проб, окисляли метан в анаэробных условиях главным образом в присутствии ацетата или формиата, а также смеси ацетата, формиата и лактата. Однако эта способность сохранялась культурами в течение не более двух пересевов на соответствующих средах. Экспериментально доказано, что аэробный метанотроф Мт. твШатса, штамм 12 не способен окислять метан в анаэробных условиях за счет восстановления аморфного оксигидроксида железа.
Ключевые слова: метан, анаэробное окисление, ингибиторный анализ, метанотрофы, метаногены, сульфатредукторы.
Характер концентрационного распределения метана в морских осадках свидетельствует, что метан не накапливается в осадках и потребляется микроорганизмами. В многочисленных радиоизотопных [1-3] и стабильно-изотопных экспериментах доказано существование наряду с аэробным и анаэробного процесса окисления метана, по крайней мере в морских экосистемах. Биологическая природа этого процесса активно обсуждается в микробиологической и геохимической литературе последние три десятилетия. Основная роль в анаэробном метанокислении первоначально отводилась сульфатредуцирующим бактериям. Теоретически вероятность окисления метана за счет сульфата не исключена, однако термодинамические расчеты свидетельствуют, что прямая реакция сульфата с метаном не обеспечивает биосинтеза достаточного для жизнедеятельности бактерий количества АТФ.
Ранее [4] было выявлено ферментативное окисление незначительных количеств метана (0.3%) культурами метанобразующих архей. Предполагалось, что анаэробный процесс окисления метана в естественных условиях может происходить за счет совместной активности микроорганизмов различных физиологических групп - метаногены могли бы окислять метан до метанола или ацетата, которые метаболизировались бы другими анаэробами, например сульфатредуцирую-щими бактериями [5]. Валентайн и Рибург [6] экспериментально и теоретически обосновали
*Адресат для корреспонденции: (valgalch@inmi.da.ru).
возможность анаэробной метанотрофии метано-генными археями с последующим окислением образовавшегося ацетата сульфатредукторами. Ле-ин с соавт. [7] на основании данных по стабильно-изотопному составу кислорода (518О) воды, сульфата, аутигенных карбонатов и бикарбонатов в Черном море подтвердили принципиальную возможность такого механизма анаэробного метанокисления.
В донных отложениях оз. Мендота выявлено окисление 14СН4 до 14СО2 [8], ингибируемое воздухом. Накопительные культуры, выделенные из осадков, анаэробно окисляли метан только при наличии сульфата и ацетата или лактата. Меченый углерод метана, при этом, переходил в углекислоту, тогда как углерод ацетата обнаруживался в клетках микроорганизмов. Тем не менее, отсутствие прогресса в выделении стабильных культур анаэробных метанотрофов (накопительных или чистых) переносит проблему анаэробного метанокисления в некую область микробиологической/биогеохимической и даже эволюционной загадочности.
Для речных осадков экспериментально показано восстановление Ре(Ш) до Ре(11) при бактериальной минерализации бутирата, этанола, метанола и триметиламина, но не метана [9]. Потехина с соавт. [10] описали "анаэробный" рост выделенной нами [11] облигатно аэробной метанокисляющей бактерии Ме№у1отопа8 твЛатса, штамм 12 за счет восстановления РеООИ. Однако прямых доказательств окисления метана этой культурой в анаэробных условиях авторами представлено не было.
Таким образом, анализ литературных данных свидетельствует, что как химическая природа окислителя метана в анаэробных условиях, так и, соответственно, ведущая роль той и/или иной физиологической группы микроорганизмов в этом процессе, остаются пока неизвестными. Тем не менее, за последние 2-3 года опубликовано значительное количество экспериментальных работ и сделаны весьма существенные подвижки в направлении разгадки проблемы анаэробного метанокисления [12-16].
Цель данной статьи - опубликование результатов экспериментов по выявлению микроорганизмов и осуществляемых ими реакций, ответственных за анаэробное окисление метана.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
География исследований и отбор проб. Материалы для исследований получены в 8-м рейсе НИС "Витязь" в октябре-декабре 1984 г. на полигонах, расположенных в различных районах Черного моря, а также в экспедиции на подводной лодке-лаборатории "Бентос-300" в паре с НИС "Дивный" в декабре 1990 г. [3]. Эксперименты проводили на борту судна, подводной лодки и в лабораториях Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино) и Института микробиологии РАН (Москва). Пробы донных осадков отбирали дночерпателем "Океан" и прямоточной геологической трубой диаметром 12 см; пробы воды - батометрами "General Oceanics" (США) или непосредственно из трубки кингстона подводной лодки; карбонатные постройки - гидравлическим манипулятором-ковшом подводной лодки.
Выделение и учет аэробных метанотрофов проводили на жидкой минеральной среде с NH4NO3 методом предельных десятикратных разведений в пробирках Хангейта ("Bellco Glass", США) в атмосфере метана и воздуха (30 : 70) [3].
Анаэробные накопительные процедуры [3]. Жидкие среды готовили из стерильных растворов (г/л дистиллированной воды): (I) NaCl - 24, MgCl2 ■ ■ 6Н2О - 11, Na2S04 - 4, KCl - 0.8, NH4Cl - 0.5; (II) КН2РО4 - 15, №2НРО4 ■ 5H2O - 30; (III) CaCl2 -100; (IV) NaBr - 8, SrCl2 ■ 6H2O - 2; (V) KF ■ 2H2O - 1; (VI) H3BO3 - 0.3, CoCl2 - 1, CuSO4 ■ 5H2O - 0.1, MnCl2 - 0.1, Na2MoO4 ■ 2H2O - 0.3, ZnSO4 ■ 7H2O - 2, NiCl2 - 0.05, H2SO4 - 2 мл; (VII) FeSO4 - 10 (в 1%-ном растворе HCl); (VIII) NaHCO3 - 20; (IX) Na2S - 100 (в 5%-ном растворе NaHCO3); (X) FeS (аморфный) -10; (XI) S0 - 50 (10%-ный раствор в ацетоне); (XII) KNO3 - 50; 5%-ные растворы (XIII) ацетата, (XIV) лактата, (XV) формиата, (XVI) метиламина и (XVII) метанола. Растворы стерилизовали 1 ч при 1 атм.
К 900 мл раствора I стерильно добавляли: раствор II - 20 мл; III-V - 10 мл; VI - 1 мл; VII - 10 мл (кроме варианта Сер); VIII - 10 мл; IX - по каплям до серого цвета среды; X и XI - 10 мл (только варианты СЕР и АЛФ); XII - 10 мл (только вариант НИТ); XIII-XVII - 10 мл (соответственно варианту среды). Анаэробиоз контролировали ре-зазурином (0.002%, рН 9.0). Всего использовано 8 вариантов сред (табл. 1): с ацетатом (АЦТ), лак-татом (ЛАК), формиатом (ФОР), метанолом (МЕ), метиламином (МА), серой (СЕР), нитратом (НИТ), а также смешанная среда АЛФ с ацетатом, лактатом и формиатом (по 2 мл растворов X-XII и XIII-XV). В качестве контроля использовали среду без органических субстратов и добавок X-XII.
Пробы восстановленных донных осадков или сероводородсодержащей воды (1 см3) вносили в 10 мл соответствующей среды в пробирках Хангейта (17 мл) с пробками из газонепроницаемой бутиловой резины ("Bellco Glass", США), продували азотом, постоянно очищаемым от примесного кислорода над медным катализатором при 800°C, а затем метаном высокой степени чистоты (99.99%). Культуры инкубировали при комнатной температуре в течение 1-6 мес.
Метанокисляющую активность накопительных анаэробных культур оценивали по скорости окисления 14СН4 до 14СО2 [3]. Из опытных пробирок отбирали по 1 мл жидкой культуры и переносили в 4 мл соответствующей среды в модифицированных пробирках Хангейта (6 мл), предварительно продутых азотом, очищенным от кислорода. В каждую пробу вносили 100 мкл раствора 14СН4 в стерильной дегазированной воде общей активностью 0.19 мкКю и инкубировали 16 ч при комнатной температуре. По окончании инкубации пробы фиксировали 0.5 мл 20%-ного раствора КОН. Пробу переносили в реакционный сосуд системы для отгонки газов из водных образцов, вносили 1 мл концентрированной ортофосфорной кислоты и отгоняли током азота в течение часа образовавшуюся меченую углекислоту, которую улавливал 2-фенилэтиламином в сцинтилляцион-ном коктейле. Радиоактивность 14СО2 в коктейле учитывали в жидкостном сцинтилляционном счетчике "RackBeta" (Швеция).
Определение интенсивностей биогеохимических процессов в пробах воды и осадков осуществляли, как описано ранее [3]. Скорости (имп/мин) метан-окисления оценивали по образованию 14СО2 и 14С-биомассы + 14С-экзометаболитов из 14СН4; ме-таногенеза - по образованию 14СН4 из NaH^O^ сульфатредукции - по образованию ^-сероводорода, 3^-пирита, ^-элементной и 3^-органичес-кой серы из Na234SO4.
Эксперименты по ингибированию и стимулированию бактериальных процессов [3]. Донные
Таблица 1. Влияние различных соединений на интенсивности метанокисления, метанобразования и сульфатре-дукции в анаэробных осадках ст. 806-3 (% от контроля без добавок)
Соединение Концентрация Окисление метана Образование метана Сульфатре-дукция
до СО2 в клетки и эк-зометаболиты суммарное
Имидазол 2 мМ 100 134 111 н.о. н.о.
CCl4 2 мМ 85 46 78 62 53
БЭС 50 мМ 103 89 96 17 105
Na2MoO4 20 мМ 100 21 85 153 38
S0 40 мг/г 122 20 103 33 130
FeSO4 10 мкг/г 112 14 94 483 127
Метанол 40 мкг/г 116 329 155 112 57
Метиламин 50 мкг/г 123 39 107 25 58
Ацетат 50 мкг/г 128 14 107 831 56
Лактат 50 мкг/г 123 23 105 59 44
Формиат 50 мкг/г 69 160 86 69 130
Глутаральдегид 10 мг/г 0 0 0 0 0
Автоклавирование 0 0 0 0 0
Примечание. н.о. - не определяли.
отложения отбирали на глубоководной станции 806-3 (Западная халистаза, 2142 м) дночерпателем "Океан". С помощью пластмассового цилиндра диаметром 20 см вырезали блок осадка, пер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.