научная статья по теме КАК ОСТАНОВИТЬ СИНТЕЗ БЕЛКОВ? Физика

Текст научной статьи на тему «КАК ОСТАНОВИТЬ СИНТЕЗ БЕЛКОВ?»

МОЛ1КУЛЯРНАЯ молот

Как остановить синтез белков?

Лев Львович Киселев, академик РАН и Европейской академии (Academia Europaea), заведующий лабораторией Института молекулярной биологии им.ВА.Энгельгард-та РАН, председатель научного совета «Геном человека», главный редактор журнала «Молекулярная биология»

Л.Л.Киселев

Благодаря достижениям молекулярной биологии последних двух десятилетий мы знаем, как инициируется белковый синтез на рибосомах (клеточных частицах, в которых протекает трансляция, т.е. синтез белков) и как происходит удлинение полипептидной цепи (элонгация). Однако завершение синтеза (терминация) оставалось вне поля зрения исследователей, хотя еще с конца 1960-х годов известны два основополагающих факта. Во-первых, синтез прекращается, когда в участке А малой субъединицы рибосомы появляется стоп-(нонсенс-)кодон. Это один из трех тринуклеотидов (УАА, УАГ, УГА), которые не кодируют аминокислот, а служат сигналом для окончания элонгации (рис.1). Во-вторых, «считывание» стоп-кодонов в рибосоме нуждается в особых белках, названных факторами освобождения полипептидных цепей (release factors, сокращенно RF). По свойствам и роли в клетке эти белки подразделяются на два класса. У бактерий известны два фактора терминации класса-1 — RF1 (узнающий стоп-кодоны УАА и УАГ) и RF2 (узнающий УАА и УГА), у архебактерий — aRFl, у эвкариот — eRFl (узнающие все три стоп-кодона).

© Л.Л.Киселев

К концу 80-х годов аминокислотная последовательность многих бактериальных факторов стала известна, а вот с eRFl произошла драматическая история, о которой я уже рассказывал [1]. Американские исследователи в результате методических ошибок приписали ему структуру совсем другого белка. Обнаружив это [2], мы смогли расшифровать истинную последовательность аминокислот eRFl [3], что позволило идентифицировать похожие на него архебактериальные факторы aRFl. При этом выяснилось, что eRFl резко отличается по структуре от ранее известных RF1 и RF2, и мы предположили, что факторы терминации бактерий и эвкариот произошли от разных предко-

вых молекул [3]. Такая гипотеза вызвала резкую критику со стороны некоторых исследователей. Однако дальнейшее изучение большого числа структур [4], а также рентгеноструктур-ный анализ кристаллов eRFl (выполненный в Англии) и RF2 (в Дании) полностью подтвердили нашу правоту.

Структуру факторов класса-2 бактериального RFЗ [5] и эвка-риотического eRFЗ [6] установили почти одновременно. Они оказались ферментами, которые катализируют внутри рибосом гидролиз гуанозинтрифосфата (ГТФ), не участвуют в терминации (расщеплении конечного продукта белкового синтеза, пептидил-тРНК), но способствуют освобождению из рибосом факторов класса-1 [7, 8].

иоякуирнм виология

полипептидная цепь

605

пептидил-

трансферазный

центр

пептидил-тРНК

еКР1

5' еСТАбААТСб

САбДиАСАСАССА 3'

405

N-домен

Рис.2. Схема трехмерной структуры е11Р1 человека по данным рентгеноструктурного анализа [12]. Ы-домен узнает стоп-кодон, М-домен находится в пептидилтрансферазном центре рибосом и участвует в гидролизе пептидил-тРНК, С-домен связывается с фактором класса-2 е11РЗ. Трипептид ЭСО находится на одном из концов молекулы еЯР 1, образуя гибкую петлю. Такое пространственное расположение обеспечивает контакт е11Р1 с пептидил-тРНК, которая располагается в соседнем с молекулой участке (Р).

Рис.1. Схема терминации белкового синтеза у эвкариот. По мере того, как молекула мРНК продвигается сквозь рибосому (состоящую из 60Э и 40Б субчастиц), ее нуклеотидная последовательность переводится в аминокислотную. Присутствие стоп-кодона 11АА и е11Р1 в А-участке рибосомы приводит к остановке синтеза — расщеплению пептидил-тРНК (освобождению полипептидной цепи).

С-домен

М-домен

Ключевая роль трипептида ССО

Бактериальные и эвкариоти-ческие факторы класса-1, несмотря на несходство своих первичных структур, имеют один общий элемент — трипептид глицил-глицил-глютамин (сокращенно 00<3). Он присутствует во всех белках класса-1,

а их сейчас известно для бактерий, архебактерий и эвкариот уже около 100 (рис.2). Обнаружив совместно с коллегами из центра по вирусологии и биотехнологии «Вектор» этот универсальный мотив, мы предположили, что он ответствен за химическую стадию терминации (расщепление пептидил-

тРНК) [9]. Это означало, что его изменение приведет к потере активности фактора, но не помешает ему связываться с рибосомой, поврежденный белок превратится в ингибитор терминации. Сам трипептид 00<3 должен находиться в большой субчастице рибосомы, в области ее пептидилтрансферазного

moflikirffimim биология

центра. При экспериментальной проверке все эти следствия полностью подтвердились.

Таким образом, удалось показать, что СЮ(2 служит активным центром факторов класса-1 (у прокариот и эвкариот) и, располагаясь в пептидилтрансфе-разном центре, катализирует расщепление эфирной связи в пептидил-тРНК. Интересно, что ключевая роль этого три-пептида в терминации обеспечивается в первую очередь двумя глициновыми остатками, а не глютамином [10—15]. Возможно, что отсутствие у глицина боковой группы освобождает пространство для молекулы воды, участвующей в гидролизе пеп-тидил-тРНК, поскольку замены глициновых остатков на более объемные неизменно ведут к утрате активности у мутантных ИЕ

Как факторы узнают стоп-кодоны?

Фактор класса-1 катализирует гидролиз, только если в А-участке малой субъединицы присутствует один из трех стоп-кодонов. Иными словами, внутри рибосомы сигнал от стоп-ко-дона (находящегося в малой субчастице) к пептидилтранс-феразному центру (расположенному в большой рибосом-ной субчастице) передается через СвС^-мотив. Как такая передача может осуществляться? Согласно одной гипотезе, стоп-ко-дон специфически связывается с участком малой рибосомной РНК, а фактор играет лишь вспомогательную роль. Согласно другой, стоп-кодон взаимодействует с «узнающим» трипеп-тидом фактора класса-1. В первом случае главную роль в передаче сигнала играет рибосома, а во втором — фактор класса-1. На основании совместных опытов с французскими [16] и японскими [17] исследователями мы отдали предпочтение второй гипотезе. Оказалось: если в пробирке создать «гибрид» из рибосомы, умеющей «считывать» все

три стоп-кодона, и фактора класса-1, выделенного из организма, где используются только один или два стоп-кодона, то результат будет зависеть от природы фактора. Отсюда можно предполагать прямой контакт еИР1 со стоп-кодоном в рибосоме. Действительно, используя синтезированные триплеты с химически модифицированными группами, мы совместно с парижскими и новосибирскими коллегами доказали, что они образуют ковалентную связь с молекулой еИР1 внутри рибосомы [18, 19]. Это возможно лишь в том случае, если они сближены внутри рибосомы. Аналогичные результаты были получены другими исследователями для факторов класса-1 и рибосом бактерий. Следовательно, факторы класса-1 должны иметь участок, специфически узнающий в рибосоме стоп-кодоны мРНК.

Недавно такой участок удалось найти у 1^1 и бактерий [20]. Это были трипептиды, но разные (поскольку 1^1 узнает УАГ, а — УГА, а УАА узнают оба фактора). Пока не показано, находятся ли они в непосредственном контакте со стоп-кодо-ном в рибосоме. Однако результат ничего не дал для понимания терминации у эвкариот, поскольку первичные и пространственные структуры этих факторов класса-1 у двух царств живой природы устроены по-разному.

Исходя из того, что расстояние между стоп-кодоном и пеп-тидилтрансферазным центром рибосом составляет примерно 75 А (это вытекает из формы и размеров тРНК и данных рентгеноструктурного анализа рибосом прокариот), узнающий участок может располагаться либо на М-концевом, либо на С-концевом доменах. Второе предположение отпадает сразу же, поскольку удаление С-доме-на не мешает узнаванию: такой укороченный белок в пробирке в полной мере сохраняет свою активность [21]. Значит, стоп-

кодон должен узнаваться N-до-меном, что подтверждается опытами с мутантным [22, 23] и «гибридным» eRFl [17], а также данными других исследователей.

Однако пока не ясно, где именно находится этот участок, так как размер N-домена достаточно велик. В поисках ответа мы проанализировали аминокислотную последовательность факторов eRFl из самых разных организмов (по данным из общедоступных банков). Два пептидных фрагмента, Асн-Иле--Лиз-Сер (NIKS) и Тир-Цис-—Фен (Y—С—F)*, расположены в петлях N-домена (полностью или частично), что облегчает им контакт со стоп-кодоном в рибосоме. Присутствие в пептидах консервативных и полуконсервативных аминокислотных остатков также не противоречит гипотезе о их возможной роли как узнающих стоп-кодон. Однако нужны были прямые экспериментальные доказательства, которые мы получили с помощью направленного мутагенеза.

Мы заменили в тетрапептиде NIKS каждую аминокислоту и посмотрели, как это сказывается на функциональной активности eRFl человека. Опыты, поставленные в пробирке, дали вполне четкие результаты [22]. Замена изолейцина (I) весьма серьезно уменьшает активность мутантного белка; эффект от замены лизина (К) гораздо мягче; крайние аминокислоты аспара-гин (N) и серин (S) занимают промежуточные положения. В целом, фрагмент NIKS безусловно функционально важен, но утверждать на основании наших данных, что именно он узнает весь стоп-кодон, вряд ли правильно.

Совершенно иную картину мы получили, когда анализировали участок Y—С—F [23]. При замене цистеина (С) или фенилаланина (F) на другие аминокислоты ответ на стоп-

* Тире означают, что между этими инвариантными аминокислотами находятся другие, варьирующие.

ИОМКТМНА1 «иояогиш

кодон УГА почти не менялся, а на УАА и УАГ падал очень сильно. Более того, если к каждой из этих мутаций добавить еще по одной — по аспарагину (¡4), стоящему между С и Б, то еКГ1 человека становится похожим на еКИ реснитчатых простейших. У них фактор узнает только УГА, а два других триплета (УАА и УАГ) превращаются в значащие, кодирующие аминокислоты. Такие белки, узнающие только один стоп-кодон, называют унипотентными, в отличие от омнипотентных еИП высших эвкариот.

Итак, направленное изменен

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Физика»