БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.978-985
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 576.322.2
КАЛЬДЕСМОН ИЗМЕНЯЕТ СТРУКТУРУ АКТИНА НА ЛИДИРУЮЩЕМ КРАЕ И ПОДАВЛЯЕТ МИГРАЦИЮ КЛЕТОК
© 2008 г. Т.В. Кудряшова, П.Н. Руткевич*, А.Я. Шевелев*, Т.Н. Власик*,
А.В. Воротников
Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119192, Москва, Ломоносовский проспект, 31, корп.5;
*Институт экспериментальной кардиологии, РКНПК, 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а
E-mail а.уогоМкоу@сагЛо.ги Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Исследован эффект подавления экспрессии актинсвязывающего белка кальдесмона на подвижность немышечных клеток. Более чем пятикратное снижение содержания этого белка в клетках с помощью PHK-интерференции приводило к нарушению образования актиновых стресс-фибрилл и ускорению миграции клеток в зону повреждения монослоя. Стимуляция стационарных клеток сывороткой вызывала более чем 1,5-кратное накопление стресс-фибрилл только в контрольных клетках, но не в клетках, дефицитных по кальдесмону. Аналогично, накопление филаментов актина наблюдалось в активно мигрирующих клетках только дикого типа, но не в клетках с пониженным содержанием кальдесмона. Эти изменения происходили в основном на лидирующем крае мигрирующей клетки, где характерная для контрольных клеток четкая структура актиновых филаментов не выявлялась в отсутствие кальдесмона. Предполагается, что кальдесмон тормозит миграцию клеток за счет стабилизации актина в филаментах и снижения динамики мономерного актина на лидирующем крае мигрирующей клетки.
Ключевые слова: кальдесмон, РНК-интерференция, клеточная миграция, актиновые филаменты, лидирующий край клетки.
Направленная миграция клеток является ключевым событием при эмбриогенезе, хоумин-ге клеток-предшественников, росте сосудов и нервных волокон, воспалительных реакциях и репарации тканевых повреждений [1]. Направление миграции определяется градиентом хе-моаттрактантов (факторов роста, цитокинов и других сигнальных молекул), рецепторы которых локализуются на лидирующем крае клетки, а также наличием свободного пространства, как в случае движения клеток в рану, или царапину, нанесенную в клеточном монослое.
Действие хемоаттрактантов реализуется внутри клетки через сходные механизмы активации клеточной подвижности, которые многообразны и пока до конца не известны. В целом, движение клетки представляет собой циклический процесс образования протрузий на переднем крае, их прикрепление к субстрату, «втекание» в них цитоплазмы, открепление и
Сокращения: ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка, иРНК - интерферирующая РНК, ОБР - зеленый флуоресцентный белок, ФСБ - фосфатно-солевой буфер, ЦБС -буфер для фиксации цитоскелетных белков, ГАФД - гли-цер альдегидфосфатдегидр огеназа.
подтягивание хвостовой части за счет сокращения цитоскелета [2]. В настоящее время считается, что динамика переднего края клетки вносит основной вклад в скорость миграции. Сигнал от связывания хемоаттрактанта с рецептором передается каскадным путем к белкам, регулирующим полимеризацию актина на первичных адгезивных комплексах в ламелли-подии - узкой лидирующей полосе на краю листообразной ламеллы. Рост нитей актина внутрь клетки сопровождается проталкиванием мембраны в противоположную сторону и образованием протрузий [3]. Пул мономерного актина восполняется в ламелле за счет деполимеризации свободных концов актиновых нитей под действием кофилина, обеспечивая необходимый «круговорот» актина [4,5].
Протрузионная активность ламеллиполий зависит от количества фокальных адгезий, числа и доступности мономеров актина, а также скорости сборки-разборки актиновых нитей [6]. Все эти параметры регулируются актинсвязы-вающими белками, активность которых находится под рецепторным контролем. Так, увеличение числа участков полимеризации и образующихся актиновых нитей достигается нук-
леирующей активностью форминов и ветвящей активностью белков Агр2/3 [7,8]. Регуляция пула мономерного актина происходит за счет изменения деполимеризующей активности кофилина и блокирующей мономерный актин активности про филина [9].
Отдельную и разнородную группу составляют белки, опосредованно влияющие на полимеризацию, деполимеризацию и стабильность актиновых нитей [10]. Как правило, это кэпирующие или латерально взаимодействующие белки, которые изменяют скорость полимеризации, доступность для кофилина, а также объединяют нити актина в устойчивые к деполимеризации стресс-фибриллы или сети акти-новых филаментов. К их числу относится каль-десмон - многофункциональный белок, взаимодействующий с актином, миозином и тропо-миозином, а также являющийся конечной мишенью нескольких рецептор-активируемых каскадов, регулирующих его активность [11]. Помимо того, что кальдесмон стабилизирует полимерный актин и меняет его механические свойства [12], он ингибирует АТФазу актомио-зина и, таким образом, может тормозить подтягивание тела клетки в процессе движения.
Ряд данных указывает на то, что кальдесмон участвует в регуляции миграции клеток [13,14], однако детальные механизмы его действия остаются неясными. Обнаружено, что кальдесмон влияет на силу адгезии клеток [15], образование подосом [16], организацию кортикального ци-тоскелета [17] и стабильность актиновых мик-рофиламентов [18]. Он также регулирует активность других актинсвязывающих белков, таких как гельзолин и тропомиозин [19], фасцин [20], Агр2/3 [21], что опосредованно влияет на динамику внутриклеточного актина. Вместе с тем роль кальдесмона в регуляции скорости миграции к настоящему времени прямо не показана.
Внутриклеточная активность кальдесмона определяется его связыванием с актином, которое регулируется фосфорилированием [22,23]. Ранее было обнаружено, что ускорение хемотаксиса требует активации МАР-киназ и фос-форилирования кальдесмона [17,24], что подавляет его связывание с цитоскелетом [25]. Фос-форилирование также регулирует активность кальдесмона в подосомах [26], кортикальном цитоскелете [27] и стресс-фибриллах [14].
Поскольку эффекты фосфорилирования кальдесмона направлены на подавление его основной активности, мы предположили, что они могут быть функционально аналогичны уменьшению его количества в клетке. В связи с этим, в настоящей работе мы исследовали, как снижение экспрессии кальдесмона в клетках влияет
на их подвижность и состояние актинового цитоскелета в лидирующем крае мигрирующих клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Подавление экспрессии кальдесмона в клетках HeLa 1469 методом РНК-интерференции.
Линейные эпителиальные клетки человека HeLa 1469 культивировали при 37°С и 5% CO2 в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Hydone, США), 2 мМ глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина.
Для получения популяций клеток HeLa 1469, со стабильно сниженной экспрессией кальдес-мона, клетки трансдуцировали лентивирусными частицами, содержащими молекулярно-генети-ческую конструкцию pSIH-CopGFP-H1shRNA (SBI, Калифорния), кодирующую последовательность интерферирующей РНК (иРНК) к участку в последовательности гена кальдесмона (или гена люциферазы в случае контрольной конструкции) и последовательность гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) под регуляцией единого промотора. Появление флуоресценции GFP в клетке после трансдукции свидетельствовало об экспрессии в данной клетке соответствующей иРНК. Эффективность трансдукции клеток оценивали цитофлуоримет-рическим методом по флуоресценции GFP.
Уровень экспрессии кальдесмона в исходных клетках через 72 ч после их трансдукции и при каждом последующем пассировании определяли иммуноблоттингом с использованием специфических антител к кальдесмону, детектирующих все изоформы этого белка, с последующей количественной денситометрией. Все эксперименты были проведены независимо для двух популяций клеток HeLa 1469, дефицитных по кальдесмону, полученных в результате двух независимых трансдукций. Данные, полученные в параллельных экспериментах, носили сходный характер.
Электрофорез и иммуноблоттинг. Клетки выращивали до монослоя, затем удаляли среду, промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержащим 5,2 мМ Na2HPO4, pH 7,4, 150 мМ Nad, лизировали в 2-кратном буфере нанесения образцов для элетрофореза по Лэммли [28] и кипятили в течение 5 мин. Концентрацию белка в образцах измеряли методом Шаффнера и Вайсмана с амидовым черным [29]. Белки разделяли электрофоретически в пластинах 10 -12% полиакриламидного геля при 160 В в присутствии 0,1% лаурилсульфата натрия (Sigma, США) по методу Лэммли [28]. Эквивалентность
нанесения количества образцов нормировали по содержанию глицеральдегидфосфатдегидро-геназы (ГАФД). После электрофореза проводили иммуноблоттинг по методу [30], используя PVDF-мембраны с размером пор 0,45 мкм (Im-mobilon, США) для электропереноса. Для последующей детекции кальдесмона и ГАФД, электроперенос осуществляли в буфере, содержащем 0,025 M триса, 0,192 M глицина, рН 8,3, 20% этанола, 0,02% лаурилсульфата натрия, рН 8,3, в течение 1 ч при силе тока 350 мА.
В работе использовали первичные поликло-нальные антитела кролика к кальдесмону, полученные и охарактеризованные ранее [31]. Первичные антитела мыши к ГАФД были любезно предоставлены Д.В. Серебряной (лаборатория иммунохимии биологического факультета МГУ). Использовали вторичные антитела против IgG мыши и IgG кролика, конъюгирован-ные с пероксидазой хрена, а также набор реагентов для проявления иммуноблотов методом усиленной хемилюминисценци фирмы Amers-ham (США). Количественный анализ осуществляли после компьютерного сканирования изображений с помощью программы Srion Image версии ImageJ (Srion Ina, США).
Cтимyляция клеток и иммуноцитоx имиче-cKoe окрашивание актина. Контрольные клетки линии HeLa 1469 и клетки со сниженной экспрессией кальдесмона выращивали до 40 - 50% конфлюентного монослоя на покровных стеклах, депривировали в среде, содержавшей 0,1% ЭТС, в течение 4 ч, после чего в течение 30 мин инкубировали в среде, содержавшей 30% ЭТС. Клетки промывали один раз фосфатно-солевым буфером (37°С) и фиксировали в течение 15 мин рас
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.