ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 2, с. 297-303
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 581.1:582.475:2
КАЛЛУСОГЕНЕЗ И ИНДУКЦИЯ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА У ГИБРИДНЫХ ЗАРОДЫШЕЙ СЕМЯН Pinus sibirica © 2014 г. И. Н. Третьякова, Е. В. Ворошилова, Д. Н. Шуваев
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт леса им. В.Н. Сукачева, Сибирское отделение РАН, Красноярск Поступила в редакцию 25.03.2013 г.
Приведены результаты многолетней работы по индукции соматического эмбриогенеза у кедра сибирского (Pinus sibirica Du Tour), произрастающего в естественном древостое и на клоновой прививочной плантации в Западном Саяне. Контролируемое опыление клонов кедра сибирского оказало положительное влияние на состояние каллусных культур. Цитологический анализ эмбрионально-суспензорной массы позволил идентифицировать эмбриологические структуры, морфологически сходные с зиготическими зародышами, находящимися на ранних стадиях развития, что служило определением каллусной ткани как эмбриогенной. Выявлены растения-доноры (клоны), зиготиче-ские зародыши которых в условиях культуры in vitro могут служить источником получения эмбрио-генной каллусной ткани.
Ключевые слова: Pinus sibirica — кедры-акселераты с однолетним развитием женских шишек — контролируемое опыление — зиготические зародыши — гибридные зародыши — каллус — эмбрионально-суспен-зорная масса — соматические зародыши
DOI: 10.7868/S0015330314020171
ВВЕДЕНИЕ
Половая репродукция сосны сибирской (кедра сибирского, Pinus sibirica Du Tour) — единственного орехоносного вида в горах Южной Сибири, характеризуется рядом признаков, отличающих его от других представителей семейства Pinaceae. Это, во-первых, высокая полиэмбриональность семян (до 16 зародышей в одном мегагаметофите), требующих длительной стратификации (4-7 мес.); во-вторых, встречаемость (частота 0.2%) в природных популяциях уникальных гетерозисных генотипов деревьев — "кедров-акселератов" — с однолетним циклом развития женской шишки (от опыления до оплодотворения проходит 2 мес. вместо 14-15 мес. [1, 2]). Однако размножение таких ге-терозисных форм естественным путем невозможно вследствие гаметофитной несовместимости и отсутствия зародыша [3, 4].
Для изучения репродуктивного процесса сосны сибирской и сохранения ее уникальных форм наиболее перспективным направлением является
Сокращения: ОЛХ — опытное лесное хозяйство; ЭК — эм-бриогенный каллус; ЭСМ — эмбрионально-суспензорная масса.
Адрес для корреспонденции: Третьякова Ираида Николаевна. 660036 Красноярск, Академгородок, 50, стр. 28. Институт леса им. В.Н. Сукачева Сибирское отделение РАН. Электронная почта: culture@ksc.krasn.ru
проведение экспериментов по контролируемому опылению и получению хозяйственно-ценных гибридов, которые можно размножать ex situ и традиционными методами биотехнологии в культуре in vitro через соматический эмбриогенез.
Соматический эмбриогенез — асексуальный способ микроклонального размножения, основанный на тотипотентности растительных клеток [5], был открыт 26 лет назад у Picea glauca [6]. К настоящему времени эмбриогенный каллус и соматические зародыши получены у 27 видов рода Pinus [7], и для более чем половины из них оптимизированы условия культивирования, обеспечивающие регенерацию из соматических зародышей целых растений. Как правило, в культуре ткани хвойных для индукции соматического эмбриогенеза в качестве первичных эксплантов используются незрелые зародыши, находящиеся на кливажной стадии развития (культура мегагаме-тофитов) и предсемядольной стадии развития (культура зародышей) [8, 9]. Частота инициации эмбриогенного каллуса у большинства изученных видов рода Pinus оказалась невысокой. У P. taeda она колебалась от 2 до 25% [10], у P. strobus от 52.9 [11] до 76% [9], у P. pinea от 0.5 до 7.2% [12], у P. pinaster в пределах 15% [13]. Выявлено, что инициация эмбриогенного каллуса и образование соматических зародышей у P. strobus [14], P. montico-
10
297
Сроки сбора семян и характеристика их состояния
Время сбора Стадия развития Размер зародыша, мм
2007, 1-10 июля инициация семядолей 1.5
2008, 1-24 июля инициация и развитие семядолей 1.5-2.0
2009, 1 августа стадия развитых семядолей 2.0
2010, 1-24 июля инициация и развитие семядолей 1.5-2.0
2011, 1-10 июля инициация семядолей 1.5
la [15], P. taeda [10], Р. sylvestris [16, 17], P.pinea [12] идет под генетическим контролем. Согласно данным [17], использование в опытах по контролируемому опылению (внутривидовая гибридизация) материнских деревьев P. sylvestris, характеризующихся высоким эмбриогенным потенциалом, позволяет значительно повысить частоту инициации эмбриогенного каллуса (ЭК), образования соматических зародышей и растений [17].
Первые результаты по индукции соматического эмбриогенеза из мегагаметофитов и незрелых зиготических зародышей у сосны сибирской нами были получены в 2009 г. [18]. При этом было показано, что инициация каллуса происходила в 58% случаев, и образование соматических зародышей в полученных каллусных культурах носило случайный характер.
Цель настоящей работы состояла в расширенном поиске растений-доноров, зиготические зародыши которых в условиях культуры in vitro могут служить надежным источником для получения эм-бриогенной каллусной ткани и соматических зародышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили 15 деревьев кедра сибирского (Pinus sibirica Du Tour) из естественного древостоя Западного Саяна (возраст 90-135 лет) и клоны кедра сибирского, произрастающие на прививочной плантации Западно-Саянского опытного лесного хозяйства (ОЛХ). Кло-новая прививочная плантация располагается на территории ОЛХ Даурского лесничества вблизи поселка Ермаковское (53° 16' с.ш. и 92°23' в.д., высота над уровнем моря 300-320 м). Плантация занимает площадь 10 га. Каждый клон представлен прививками черенков плюсовых деревьев кедра сибирского (277, 275, 280, 281, 002, 145, 153) из естественного древостоя в Западном Саяне,
выделенных Ю.А. Череповским с сотр. (личное сообщение) и состоит из 12-15 деревьев (рамет). В качестве подвоя были использованы 4-летние сеянцы дерева 277.
В 2007-2011 гг. на семи высокоурожайных 1520-летних клонах (277/22, 275/20, 280/25, 281/26, 002, 145/4, 153/13) проводили опыты по контролируемому опылению. Для опыления клонов собирали пыльцу с двух деревьев-акселератов с однолетним циклом развития женской шишки (деревья 106 и 107) и четырех плюсовых деревьев (492, 277, 357, 2к), характеризующихся стабильно высокой семенной продуктивностью женских шишек и крупными полиэмбриональными семенами [3]. Эти деревья произрастали в естественном древостое Западного Саяна. Возраст деревьев 100-110 лет. Со всех опытных деревьев, "отцовских" и "материнских" (клоны), проводили сбор шишек и семян, полученных в результате свободного опыления, а также при контролируемом опылении клонов и их самоопылении. Гибридные семена были получены от 49 вариантов контролируемого опыления.
Растительный материал. В качестве эксплантов для индукции каллуса использовали незрелые зи-готические зародыши, длина которых не превышала 2 мм. В период с 2007 по 2011 г. от каждого дерева, клона, варианта контролируемого опыления в культуру in vitro вводили от 20 до 50 зародышей, которые вычленяли из незрелых семян. Сроки сбора семян приведены в таблице.
Мегагаметофиты извлекали из семян и стерилизовали гипохлоритом натрия или 3% раствором йода в 90% спирте, с последующим трехкратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. В стерильных условиях зародыши извлекали из мегагаметофитов, помещали на питательную среду 1/2 нормы LV [19], с добавлением мезоино-зита (0.1 г/л), L-глутамина (1.45 г/л), фитогормо-нов: 2,4-Д (2.0 мг/л) и 6-БАП (1.0 мг/л), сахарозы (30 г/л), а также агара (7 г/л), и культивировали в течение 30 сут. в темноте при 25° ± 1°С. Затем обросшие каллусом зародыши переносили на среду для пролиферации 1/2 нормы LV с пониженными концентрациями гормона 6-БАП (0.5 мг/л) и сахарозы (20 г/л). Культивирование проводили в тех же условиях с интервалом между пересадками 14 сут. Кроме того, в 2011 г. после сбора семена выдерживали в холодильной камере при температуре 0-2°С, в течение 1-2 мес., и в среды для инициации и пролиферации вводили аскорбиновую кислоту в концентрации 300 мг/л.
Цитологический анализ. Идентификацию образования соматических зародышей в полученных каллусных культурах проводили на 30-60-е
сутки с использованием временных давленых препаратов, окрашенных водным раствором сафранина (2 мг/мл) с добавлением капли метилено-вого синего. Просмотр образцов осуществляли на микроскопе МИКМЕД-6 (Россия). Измерения клеток и эмбриональных структур проводили при помощи окуляр-микрометра с последующим переводом полученных единиц в микрометры. В каждом образце измеряли по 100-150 клеток.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Microsoft Excel 2003.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Каллусогенез у зародышей семян, собранных у свободноопыленных (открытое опыление) деревьев из естественного древостоя и деревьев-клонов
В 2008 г. в культуру in vitro были введены зиго-тические зародыши от 15 деревьев, произрастающих в естественном древостое Западного Саяна. Образование каллуса наблюдалось у значительного большинства эксплантов (75-80%) в области зародышевого корешка на 4-8-е сутки культивирования, как у зародышей семян, собранных у деревьев из естественного древостоя, так и деревьев-клонов (рис. 1а). Через 30 сут. культивирования каллусы образовывались по всей длине гипокотиля (рис. 1б).
После 60 сут. культивирования в каллусах появились некротические образования. У эксплантов трех деревьев: 277, 357 и 358, каллусогенез продолжался в течение 7-10 мес., у эксплантов других деревьев - в течение 3-5 мес., после чего каллусы бурели и отмирали. Проводившийся на протяжении всего времени культивирования цитологический анализ не выявил каких-либо эмбриональных структур в каллусе. Каллус состоял из изодиаметрических клеток. Таким образом, у эксплантов из естественного древостоя формировались неэмбриогенные каллусы (рис. 1в).
В 2010 г. на клоновой п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.