ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 6, с. 695- 702
УДК 577.152.34:616-092.9
КАЛЬПАИНЫ И ИХ ЭНДО- И ЭКЗОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ В РАЗЛИЧНЫХ МОДЕЛЯХ НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ
© 2014 г. Л. А. Лысенко#, Н. П. Канцерова, Н. Л. Рендаков, Н. Н. Немова
ФГБУНИнститут биологии Карельского научного центра Российской академии наук, 185910, Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 Поступила в редакцию 21.05.2014 г. Принята к печати 20.06.2014 г.
На основании данных, полученных в серии экспериментов с лабораторными животными, сделаны заключения об изменении активности кальцийзависимых протеиназ в мозге крыс с индуцированной нейродегенерацией. Охарактеризованы свойства протеолитического и регуляторного компонентов кальпаиновой системы при действии нейротоксичных агентов — амилоидного Р-пептида и глутамата, а также установлены основные эндогенные регуляторные механизмы изменения интенсивности кальцийзависимого протеолиза. На изученных моделях нейродегенерации протестированы нейропротективные свойства экзогенных регуляторов кальпаинов, действующих по разным механизмам, — половых стероидов и регуляторов кальциевых каналов.
Ключевые слова: кальпаин, кальпастатин, кальций, амилоидный бета-пептид, глутамат, нейродегене-рация.
DOI: 10.7868/S0132342314060098
ВВЕДЕНИЕ
Кальпаин/кальпастатиновая протеолитическая система регулирует широкий спектр клеточных процессов [1, 2] и представлена во всех тканях млекопитающих основными формами Са2+-зависимых протеиназ — ц- и т-кальпаинами (КФ 3.4.22.52 и 3.4.22.53, соответственно) и их ингибитором — кальпастатином [1, 3]. Эта высокочувствительная и эффективная система из трех основных компонентов (протеиназ, ингибитора и активатора — Са2+) связана взаимной регуляцией ее составляющих. Дисбаланс в этом протеолитическом союзе, наблюдаемый обычно при повышении уровня внутриклеточного Са2+, приводит к нерегулируемой деградации внутриклеточных структур и усилению кальпа-инзависимых путей клеточной гибели [4, 5], в результате чего развивается тканевая патология: чаще —дегенерация (в скелетных мышцах, сетчатке, тканях ЦНС), иногда — избыточная пролиферация [6, 7]. Определение абсолютного количества разных форм кальпаина и кальпастатина в тканях сопряжено с рядом методических трудностей [1]; физиологическое соотношение ц- и т-кальпаи-
Сокращения: ОТТ — дитиотреитол; БОТА — натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты; РМ8Б — фе-нилметилсульфонилфторид, БА — болезнь Альцгеймера, НД — нейродегенерация, НДЗ — нейродегенеративные заболевания.
#Автор для связи (тел.: +7(8142) 571879; факс: +7 (8142) 769810; эл. почта: l-lysenko@yandex.ru).
нов в разных отделах ЦНС оценивается как 1 : 9, при этом количество кальпастатина достаточно для полного угнетения активности всего пула кальпаинов, поскольку в общих (неразделенных) тканевых экстрактах активность кальпаинов не выявляется [1, 3].
Кальпастатин — высокоспецифичный белковый ингибитор ц- и m-кальпаинов — представлен в тканях рядом сплайс-вариантов. В составе комплекса с кальпастатином кальпаин утрачивает способность к примембранной транслокации, аутоактивации и проявлению каталитической активности. Молекулярный механизм взаимодействия кальпаинов и кальпастатина зависит от ионов кальция (Са2+) и к настоящему времени описан в деталях [8]. Регуляция уровня кальпас-татина в растворимой фракции клетки, с одной стороны, зависит от скоординированного действия сАМР-зависимой протеинкиназы А (PKA), способствующей образованию агрегатов кальпас-татина и сокращению количества его молекул, доступных для взаимодействия с кальпаином, а с другой — от протеинфосфатазы, индуцирующей освобождение молекул кальпастатина из агрегатов [9]. Кроме того, при длительном повышении активности кальпаинов кальпастатин подвергается кальпаинзависимой деградации, приводящей к еще более значительной активации фермента посредством положительной обратной связи. Вместе с тем, при истощении пула ингибитора стимулируется экспрессия его гена, CAST [9].
Другой внутриклеточный регулятор кальпаи-нов — ионизированный кальций; по чувствительности к нему различают ц- и т-формы фермента: оптимум для активации ц-кальпаина лежит в микромолярном, а т-кальпаина — в миллимо-лярном диапазоне Са2+ [10]. Механизм связывания Са2+ и Са2+-индуцируемой активации каль-паинов уже хорошо изучен [11]. Баланс внутриклеточного Са2+ строго регулируется системой Са2+-переносчиков в плазмалемме и мембранах органелл [12]. Однако, развитие тканевой патологии, включая нейродегенерацию, приводит к повышению уровня Са2+ и к ожидаемой активации кальпаинов [4, 7, 13—16]. Поскольку ряд белков-переносчиков Са2+ являются субстратами кальпаинов, в этих условиях происходит их избыточная деградация, еще более усиливающая проблему дисбаланса Са2+ и нерегулируемой активности кальпаинов. Так, при нейродегенерации наблюдается кальпаининдуцированная дисфункция №+/Са2+-обменника ^СХ3) [17] и потенциалуправляемых Са2+-каналов L-типа [18].
Развитие нейродегенеративных заболеваний (НДЗ) связывают, прежде всего, с аккумуляцией патогенных конформеров белков (специфичных для каждого НДЗ) в определенной зоне мозга [19]. Так, в основе патогенеза болезни Альцгеймера (БА) лежит аккумуляция пептидов Ар1-40 и Ар1-42 — фрагментов амилоидного белка-предшественника [20], и тау-протеина [21], главным образом, в гиппо-кампе и коре больших полушарий мозга. Вне зависимости от природы белка с проагрегантными свойствами и локализации белковых агрегатов (вне- или внутриклеточной), всем им присуща цитотоксичность, реализуемая путем изменения базовых биохимических параметров в поврежденных зонах мозга, преимущественно, баланса внутриклеточного кальция [15, 22—24].
Свой вклад в повреждение ЦНС и в дизрегуля-цию Са2+ при острых и хронических НДЗ вносит феномен эксайтотоксичности — гиперстимуляции глутаматергических рецепторов, преимущественно рецепторов ^-метил-^-аспартата ^МЭА), которые являются Са2+-каналами [24, 25]. Результирующий избыток Са2+ в цитоплазме вызывает персистентную "патологическую" активацию кальпаинов. Нерегулируемый гидролиз субстратов кальпаинов — структурных и регуляторных белков нервной ткани, в том числе проапоптоти-ческих, негативно сказывается на морфологии и функциях нейронов и приводит к подавлению базовых механизмов их выживания [14, 15, 26, 27]. Механизмы плейотропного действия кальпаинов в стимуляции нейрональной гибели рассмотрены в недавних обзорах [14, 28].
Фармакологические препараты, избирательно воздействующие на кальпаины, в клинике пока отсутствуют. Вместе с тем, среди одобренных к применению препаратов присутствуют регулято-
ры кальциевых каналов и ряд стероидных гормонов, которые способны влиять на протеолитиче-ские каскады и оказывать непрямое модулирующее действие на активность кальпаинов.
С учетом вышесказанного, цель нашей работы состояла в изучении состояния ферментативного и регуляторного компонентов кальпаин/кальпас-татиновой системы в головном мозге крыс, поврежденном введением нейротоксичных агентов, а также в оценке эффективности регуляции ее активности путем введения потенциальных нейро-протекторов — экзогенных стероидов и блокато-ров кальциевых каналов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В серии экспериментов была изучена активность кальпаин/кальпастатиновой протеолити-ческой системы при развитии индуцированной нейропатологии у крыс. О функциональной активности этой системы в условиях эксперимента судили по уровню протеолитической активности доминирующих форм кальпаинов (ц- и т-каль-паинов) и количественному содержанию их эндогенного ингибитора — кальпастатина. Для получения более полной картины изменений системы и с учетом роли аутокаталитической реакции в активации кальпаинов [1] методом зимографии с казеином определяли соотношение молекулярных форм ц- и т-кальпаинов, как полноразмерных, так и аутолизованных.
Интактные животные. В норме, в разных отделах головного мозга крыс (исследованы кора больших полушарий и гиппокамп) основная активность кальпаинов определяется в цитоплазматической (растворимой) фракции: свыше 90% — для коры мозга, свыше 80% — для гиппокампа (рис. 1 и 2 соответственно). Вместе с тем, учитывая эффект связывания этих протеиназ с мембранными фосфоли-пидами для их активации [1, 29], наиболее показательной представляется активность их минорной фракции, ассоциированной с мембранными структурами (грубой митохондриальной, микросомной, миелиновой). Соотношение пула кальпаинов в растворимой и мебраносвязанной фракциях для большинства тканей млекопитающих составляет 8—9 : 1 [1, 30] и аналогично полученным нами результатам. Кальпастатин обнаруживается во всех исследованных отделах мозга. Его уровень в физиологических условиях достаточен для полного угнетения активности всего пула кальпаинов [31], и тонкая регуляция этой протеолитической системы достигается за счет соотношения фермента и ингибитора в конкретном локусе клетки [1, 9].
Ложнооперированные животные. Оперативное вмешательство (интрацеребральная инъекция физиологического раствора и наркотизация животного) оказывают достоверное влияние на общую активность кальпаинов как в поврежденном инъекцией отделе мозга (СА1-область правого
12 3 4
12 3 4
Рис. 1. Активность кальпаинов при хронической амилоидной нейротоксичности. На графике: удельная активность кальпаинов в растворимой (1) и мембра-носвязанной (2) фракциях коры больших полушарий. На врезке: зимограмма с казеином, демонстрирующая распределение молекулярных форм активных кальпаинов. По оси абсцисс: группы животных: 1 — ин-тактные, 2 —ложнооперированные; 3 — инъекция пептида АР1-40; 4 — сочетанное действие пептида АР^^ и 17р-эстрадиола.
12 3 4
Рис. 2. Активность кальпаинов при острой глутамат-ной нейротоксичности. На графике: удельная активность кальпаинов в растворимой (1) и мембраносвя-занной (2) фракциях гиппокампа. На врезке: зимо-грамма с казеином, демонстрирующая распределение молекулярных форм активных кальпаинов. По оси абсцисс: группы животных: 1 — интактные, 2 —ложнооперированные; 3 — инъекция глутамата; 4 — соче-танное действие глутамата и нифедипина.
гиппокампа), так и, в меньшей степ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.