научная статья по теме КАЛЬЦИЙ-АКТИВИРУЕМЫЕ K+-КАНАЛЫ БОЛЬШОЙ ПРОВОДИМОСТИ В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА Биология

Текст научной статьи на тему «КАЛЬЦИЙ-АКТИВИРУЕМЫЕ K+-КАНАЛЫ БОЛЬШОЙ ПРОВОДИМОСТИ В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА»

УДК 577.352.465

КАЛЬЦИЙ-АКТИВИРУЕМЫЕ ^-КАНАЛЫ БОЛЬШОЙ ПРОВОДИМОСТИ В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ

КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

© 2015 г. М. В. Тарасов1, О. А. Рогачевская1, В. Ю. Сысоева2, С. С. Колесников1*

Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3; *электронная почта: staskolesnikov@yahoo.com 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, 119192,

Москва, Ломоносовский просп., 31, корп.5 Поступила в редакцию 13.10.2014 г.

Механизмы электрогенеза в мезенхимальных стромальных клетках (МСК) изучены недостаточно, в частности, мало известно о спектре и свойствах ионных каналов, активных в покое и активирующихся при стимуляции МСК. Некоторые агонисты гептаспиральных рецепторов способны инициировать Са2+ сигнализацию в цитоплазме МСК. Поэтому несомненный интерес представляет роль Са2+-активируемых ионных каналов в генерации физиологических ответов МСК на Са2+-мобили-зующие агонисты. Целью данной работы было исследование Са2+-активируемых токов в МСК человека методом patch clamp и идентификация соответствующих ионных каналов с использованием ингибиторного анализа. Оценивались электрофизиологические характеристики клеток в покое и при аппликации Са2+-ионофора, который вызывал существенное увеличение концентрации внутриклеточного Са2+. Оказалось, что в покоящихся клетках интегральная ионная проницаемость плазмалеммы характеризовалась почти линейной вольт-амперной (I-V) характеристикой c наклоном 0.3—3 нСм и потенциалом реверсии —30...—10 мВ. В присутствии иономицина наблюдалось существенное увеличение интегральной проводимости, и I-V кривая становилась нелинейной с выраженным выходным выпрямлением в области положительных потенциалов. Потенциал реверсии интегральных токов смещался в сторону потенциала Нернста при физиологическом градиенте ионов К+. Эффекты иономицина ингибировались ибериотоксином — специфическим блокатором Са2+-активируемых К+-каналов BK-типа. Природный липидный медиатор — арахидоновая кислота — потенцировал Са2+-активируемые К+-токи в МСК. Пуринергический агонист АТР, который мобилизовал Са2+ в цитоплазме МСК, также стимулировал выходящие К+-токи, блокируемые ибериотоксином. Полученные данные свидетельствуют о том, что ВК-каналы функциональны практически в каждой МСК и могут быть вовлечены в генерацию клеточных ответов на агонисты, мобилизующие внутриклеточный Са2+.

Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки человека, Са2+-активируемые К+-каналы, иономицин, ATP.

DOI: 10.7868/S0233475515010089

ВВЕДЕНИЕ

Мезенхимальные стволовые клетки — это малочисленная популяция, обнаруженная в красном костном мозге и таких структурах, как жировая ткань, синовиальные оболочки, дерма, надкостница и молочные зубы [1]. Весьма сложной, если вообще разрешимой, является задача физиологических исследований индивидуальных ме-зенхимальных стволовых клеток in situ. Поэтому для анализа физиологических процессов используются клетки, выделенные по определенной методике из разных тканей и поддерживаемые в первичной культуре, для которых используется специальный термин — мезенхимальные стро-

мальные клетки (МСК) [2]. Ранее было показано, что агонисты различных гептаспиральных рецепторов, включая ATP, норадреналин и адреналин, серотонин, ГАМК, ацетилхолин, способны инициировать Са2+-сигналы в цитоплазме МСК [3]. Хотя функциональная значимость Са2+ сигнализации в МСК детально не анализировалась, одна из возможностей состоит в том, что достаточное повышение внутриклеточного Са2+ может приводить к изменению активности Са2+-зависимых ионных каналов, тем самым меняя мембранный потенциал плазмалеммы и активность потенциал-зависимых мембранных белков. В настоящее время известно несколько типов ионных кана-

лов, активность которых напрямую регулируется цитоплазматическим Са2+ за счет связывания этого иона канальным белком [4—6]. Целью данной работы было исследование Са2+-активируе-мых токов МСК методом patch clamp и идентификация соответствующих ионных каналов с использованием ингибиторного анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение МСК и их культивирование. МСК

человека выделяли из подкожной жировой клетчатки согласно [3]. Выделенные МСК культивировали на пластиковых чашках Петри (Corning, США) и/или в 12-луночном планшете в среде Advance Stem (HyClone, США) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. При достижении 80% монослоя клетки пассировали. Клетки обрабатывали раствором Версена (Sigma) и HyQTase Cell Detachment Solution (HyClone), а затем рассаживали в соотношении 1 : 4. В экспериментах использовали МСК 2—4 пассажей. Перед экспериментом клетки культивировали в среде (см. выше) без антибиотика в течение 12 ч. Затем клетки двукратно промывали раствором Версена (Sigma). Для отделения от субстрата клетки инкубировали в течение 3—5 мин в 200 мкл фермента HyQTase (HyClone). Фермент ингибировали добавлением 800 мкл полной ростовой среды, клетки ресуспендировали и помещали в эппендорф. Клетки осаждали центрифугированием при 0.8 g в течение 45 с и хранили в течение 2—3 ч при комнатной температуре 22—24°C. Часть клеток забирали по мере необходимости пластиковой пипеткой и помещали в электрофизиологическую камеру, описанную ранее [7].

Электрофизиология. Электрическую активность МСК регистрировали методом patch clamp в конфигурации perforated patch с использованием усилителя Axopatch 200B, ЦАП-АЦП конвертера Digidata 1322A и пакета лицензионных программ pClamp8.0 (все Axon Instruments, США). Клетки в электрофизиологической камере визуализировали с использованием микроскопа Axioscop-2 ^arl Zeiss, Германия) и объектива LD A-Plan 32х. Базовый внутриклеточный раствор содержал, мМ: 140 KCl, 1 MgSO4, 0.1 EGTA, 10 HEPES-KOH (KOH), Amphotericin B (400 мкг/мл), pH 7.3. Базовый внеклеточный раствор содержал, мМ: 135 NaCl, 5 KCl, 0.8 MgSO4, 2 CaCl2, 10 HEPES-NaOH (NaOH), pH 7.4. Система перфузии [7] обеспечивала смену раствора камеры со скоростью 0.1-1 мл/с. Опыты проводили при комнатной температуре 22-24°C.

Микрофотометрия. Эксперименты проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Axioskop 2 plus (Carl Zeiss, Германия), обо-

рудованного объективом Plan NeoFluar 20х/0.75 и цифровой ECCD камерой LucaR (Andor Technology, США). Помимо осветителя проходящего света, микроскоп был оборудован оптоволоконным осветителем на сверхъярких диодах (340—535 нм) [8] для возбуждения флуоресценции через объектив. Флуоресценцию клеток, нагруженных Fluo-4, возбуждали при длине волны 480 ± 5 нм, а эмиссию регистрировали в области 535 ± 20 нм. Каждую секунду регистрировались последовательные флуоресцентные изображения. Изменение концентрации ионов кальция в цитоплазме индивидуальных клеток оценивали по относительному изменению интенсивности флуоресценции целой клетки AF/F0, где AF = F — F0, F — текущая интенсивность флуоресценции, F0 — интенсивность флуоресценции в момент начала регистрации. Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли с использованием программы Imaging Workbench 6 (INDEC, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В общей сложности нам удалось получить достаточно стабильные регистрации примерно от 150 клеток, которые обычно поддерживались при потенциале —40 мВ и стимулировались электрическими импульсами длительностью 150 мс в пределах от —100 до 80 мВ. В покое клетки имели входное сопротивление в диапазоне 0.3—3 ГОм, а интегральная ионная проницаемость плазмалем-мы характеризовалась почти линейной вольт-амперной (1—У) характеристикой с потенциалом реверсии в области —30...—10 мВ (п = 32). С целью идентификации Са2+-активируемых токов в исследуемых клетках в ряде экспериментов в внеклеточный раствор добавляли Са2+-ионофор иономицин (5—10 мкМ), что должно было инициировать подъем внутриклеточного Са2+ до уровня, достаточного для стимуляции Са2+-зави-симых каналов. Оказалось, что через 3—5 с после аппликации иономицина практически в каждой клетке (п = 53) наблюдалось существенное увеличение интегральной проводимости, что было особенно выражено в области положительных мембранных потенциалов (рис. 1). Репрезентативная кривая, представленная на рис. 1а, иллюстрирует динамику изменения интегрального тока при 80 мВ, измерявшегося в процессе аппликации иономицина и после его отмывки, в одной из исследованных МСК. В моменты времени, обозначенные символами, снимались Т-К-кривые клетки. В частности, на рис. 1б представлены семейства интегральных токов, измерявшихся в контроле (рис. 1а, 0 с), в присутствии иономицина (рис. 1а, 20 с) и после его отмывки (рис. 1а, 140 с). Соответствующие Т-К-кривые представлены на рис. 1в. Как правило, выходящий ток при потен-

s <

а а

к х

^ Д

8 S

* £

¡5 to

I §

§ В

& si

CD

н н

X о

К с

о

н «

3 X л

л

(D

н

к

И

Иономицин, 10 мкМ

80 мВ

20 40

60 80 Время, с в

200

100 120 140

Иономицин

Контроль Отмывка

100 мВ

~[-40мВ

Контроль

Иономицин

25 мс

1 нА

-80 -40 0 40 80 Мембранный потенциал, мВ

Отмывка

Рис. 1. Иономицин стимулирует активность К+-каналов МСК. а — Репрезентативная серия регистраций интегрального тока при потенциале 80 мВ в контроле в процессе аппликации и отмывки иономицина (10 мкМ). Ток измеряли каждые 20 с. б — Семейство интегральных токов, регистрируемых в той же клетке в контроле, в присутствии 10 мкМ иономицина и после отмывки. Клетку поддерживали при потенциале —40 мВ и поляризовали электрическими импульсами длительностью 150 мс в пределах от —100 до 80 мВ (верхняя панель в б). Токи измеряли в моменты, обозначенные в а как 0 с (контроль), 20 с (иономицин) и 140 с (отмывка). в — /-^-характеристики, полученные на основе реализаций, представленных в б. Вставка, /-V-кривые в контроле и в присутствии иономицина, представленные в более узком диапазоне переменных. Уровень нулевого тока обозначен пунктиром. Электрод содержал 140 мМ KCl, внеклеточная среда - 135 мМ NaCl + 5 мМ KCl.

а

6

4

2

0

0

6

5

4

3

2

1

0

циале 80 мВ достигал максимума через 15—20 с после аппликации ионофора и превышал ток в контроле в 10—80 раз (рис. 1). Эффекты иономицина

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»