УДК 577.352.465
КАЛЬЦИЙ-ИНДУЦИРОВАННЫЙ ВЫБРОС ДЕПОНИРОВАННОГО КАЛЬЦИЯ ОПРЕДЕЛЯЕТ ТРИГГЕРНЫЙ ХАРАКТЕР ОТВЕТОВ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА НОРАДРЕНАЛИН
© 2013 г. П. Д. Котова1, П. А. Тюрин-Кузьмин2, О. А. Рогачевская1, Ю. И. Фадеева2, В. Ю. Сысоева2, В. А. Ткачук2, С. С. Колесников1*
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3; *электронная почта: staskolesnikov@yahoo.com 2Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119192, Москва, Ломоносовский просп., 31, корп. 5 Поступила в редакцию 28.05.2013 г.
С помощью флуоресцентной микроскопии и Са2+-индикатора Б1ио-4 анализировали способность различных агонистов гептаспиральных рецепторов (0-рго1ет-соир1еф стимулировать Са2+-сигна-лизацию в мезенхимальных стромальных клетках (МСК) жировой ткани человека в культуре. В частности, была идентифицирована ~5% субпопуляция клеток, специфически отвечающих на но-радреналин мобилизацией внутриклеточного Са2+. Характерной особенностью этих клеток оказалось то, что ответы на норадреналин генерировались по принципу "все или ничего": агонист либо не стимулировал детектируемую мобилизацию цитозольного Са2+ при концентрации меньше пороговой (100—200 нМ), либо вызывал Са2+-ответы практически максимальной амплитуды. Используя фотолиз фоточувствительного Са2+-хелатора МР-БОТЛ, создавались локальные и глобальные изменения свободного Са2+ в цитоплазме МСК. Тотальное скачкообразное повышение концентрации Са2+ выше порогового вызывало норадреналин-подобные ответы клеток. При локальном высвобождении Са2+ скорость распространения Са2+-сигнала в цитоплазме МСК на два порядка превышала скорость пассивного распространения за счет диффузии в присутствии Са2+-буфера. Эти факты свидетельствовали о том, что в МСК функционирует механизм, обеспечивающий Са2+-инду-цированное высвобождение депонированного Са2+. Ингибиторный анализ показал, что из двух возможных мишеней внутриклеточного Са2+, обеспечивающих запуск регенеративного процесса, — ри-анодинового рецептора и 1Р3-рецептора — именно последний выполняет роль триггера. Полученные данные позволяют предположить, что триггерный характер ответов МСК на норадреналин определяется тем, что по достижении порогового уровня первоначальный агонист-зависимый подъем внутриклеточного Са2+ стимулирует 1Р3-рецепторы и запускает лавинообразный выброс Са2+ из депо.
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки, адренорецепторы, Са2+-сигнализация, риа-нодиновые и 1Р3-рецепторы.
DOI: 10.7868/S0233475513050083
Большинство работ с мезенхимальными стволовыми клетками посвящены анализу их трансплантационного потенциала, исследованию их дифференцировки и возможности управлять этим процессом in vitro [1, 2]. Фундаментальным исследованиям физиологических процессов в этих клетках уделяется гораздо меньшее внимание, в силу чего существующие представления об их рецепторных и сигнальных системах весьма ограничены. Хотя внутриклеточные ионы кальция являются универсальным регулятором процессов пролиферации и дифференцировки и одним из основных медиаторов, вовлеченных во внутриклеточную сигнализацию, исследования в
данной области представлены единичными работами. Преимущественно они касаются изучения спонтанных кальциевых осцилляций и участия внешнего кальция в развитии мезенхимальных стволовых клеток [3]. Между тем, более актуальным представляется изучение индуцированной Са2+-сигнализации, т.е. сигнализации, стимулируемой внешним воздействием, в том числе аго-нистами различных рецепторов. Среди них могут оказаться агенты, запускающие дифференциров-ку этих клеток, что представляет несомненный практический интерес.
Весьма сложной, если вообще разрешимой, является задача физиологических исследований
индивидуальных мезенхимальных стволовых клеток in situ. Поэтому обычно анализируются стволовые клетки, выделенные по определенной методике из разных тканей и поддерживаемые в первичной культуре, для которых используется специальный термин — мезенхимальные стро-мальные клетки (МСК) [4]. Одной из текущих задач наших исследований является анализ физиологических процессов в МСК, полученных из жировой ткани человека. Оценивая их способность отвечать на различные агонисты гептаспираль-ных (G-protein-coupled) рецепторов, мы, в частности, установили, что норадреналин стимулирует Са2+-сигнализацию в этих клетках. В данной работе мы демонстрируем триггерный характер Са2+-ответов МСК на норадреналин и показываем, что это характерное свойство детерминируется механизмом Са2+-индуцированного высвобождения депонированного Са2+.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение МСК из жировой ткани и их культивирование. МСК человека выделяли из подкожной жировой клетчатки здоровых доноров (возраст от 31 до 50 лет, n = 18). Жировую ткань измельчали и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл) (Worthington, США) и диспазы (40 ед/мл) (Sigma, США) в соотношении объема ткани к объему ферментативного раствора 1 : 2. Суспензию инкубировали при 37°С в течение 30—60 мин, периодически встряхивали. Затем к полученной суспензии добавляли равный объем среды Basal Medium for Undifferentiated Human Mesenchymal Stem Cell (HyClone, США), содержащей 10% Advance Stem Supplement (HyClone) для инактивации ферментов, и центрифугировали при 200g 10 мин. Супернатант и фракцию адипоцитов удаляли. Осадок ресус-пендировали и лизировали эритроциты. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм (BD Bioscience, США). Клетки ресуспендировали в среде роста (см. ниже), высаживали в чашки Петри в количестве 100 тыс. клеток/мл и инкубировали при 37°С, 5% СО2. На следующий день в чашках меняли среду для удаления неприкрепленных клеток.
Выделенные МСК культивировали на пластиковых чашках Петри (Corning, США) и/или в 12-луночном планшете в среде Advance Stem (HyClone) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. При достижении 80% монослоя клетки пассировали. Клетки обрабатывали раствором Версена (Sigma) и HyQTase Cell Detachment Solution (HyClone), а затем рассаживали в соотно-
шении 1 : 4. В экспериментах использовали МCK 2—4 пассажей.
Подготовка клеток к эксперименту. Перед экспериментом клетки культивировались в среде (см. выше) без антибиотика в течение 12 ч. Затем клетки двукратно промывались раствором Версе-на (Sigma). Для отделения от субстрата клетки инкубировались 3—5 мин в 2CC мкл фермента HyQTase (HyClone). Фермент ингибировался добавлением BCC мкл полной ростовой среды, клетки ресуспендировались и помещались в эппен-дорф. Kлетки осаждались центрифугированием при 0.8g в течение 45 с.
Елетки прикреплялись с помощью Cell Tak на дно фотометрической камеры, представляющей собой покровное стекло Menzel-Glaser с пластиковыми бортиками, и затем загружались флуоресцентным Cа2+-зондом Fluo-4. Для этого клетки инкубировались при комнатной температуре (23—25°C) в присутствии проникающего аналога Fluo-4AM (4 мкМ) в присутствии детергента Plu-ronic (0.02%) (оба Molecular Probes, CШA) 20 мин, в течение которых гидролиз внутриклеточными эстеразами ацетоксиметиловой группы Fluo-4AM продуцировал достаточное количество Fluo-4. Затем клетки отмывались внеклеточным раствором (NaCl - 110 мМ, KCl - 5.5 мМ, CaCl2 - 2 мМ, MgSO4 - 0.8 мМ, NaH2PO4 - 1 мМ, HEPES -10 мМ, глюкоза - 10 мМ), в котором они выдерживались при 4°C в течение 40 мин. ^гда требовалось, 2 мМ CaCl2 во внеклеточном растворе заменялся на 0.5 мМ EGTA + 0.4 мМ CaCl2, при которых концентрация свободного Cа2+ составляла 260 нМ.
Микрофотометрия. Большинство описанных экспериментов проводилось с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Zeiss, Германия), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20x/0.75 и цифровой ECCD камерой LucaR (Andor Technology, CШA). Помимо осветителя проходящего света микроскоп был оборудован оптоволоконным осветителем для освещения через объектив. Один из входов бифуркационного оптического волокна соединялся с осветителем на сверхъярких диодах (340-535 нм) [5] для возбуждения флуоресценции, а другой - с лазером LCS-DTL-374QT (Лазер-Экспорт, Россия), который использовался для стимуляции фотолиза на длине волны 355 нм. Флуоресценция клеток, нагруженных Fluo-4, возбуждалась на длине волны 480 ± 5 нм, а эмиссия регистрировалась в области 535 ± 20 нм. Еаж-дую секунду регистрировались последовательные флуоресцентные изображения. Изменение концентрации цитозольного кальция в индивидуальных клетках оценивалось по относительному изменению интенсивности флуоресценции целой
клетки (AF/F0). Количественный фотометрический анализ изображений осуществлялся с использованием программы Imaging Workbench 6 (INDEC, США).
Для скачкообразного изменения внутриклеточного Са2+ использовался фоточувствительный Са2+-хелатор NP-EGTA. Фотолиз этого вещества вспышкой света ультрафиолетового диапазона (355 нм) инициировал импульсное высвобождение Са2+ в цитоплазме клетки. В соответствующих экспериментах клетки одновременно нагружались Fluo-4 и NP-EGTA.
Конфокальная микроскопия. В ряде экспериментов анализировалось распространение Са2+-сигнала в клетках с использованием конфокального сканирующего микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Germany) и объектива с масляной иммерсией Leica HCX PL APO CS 63.0 x 1.40. Клетки за сутки до эксперимента высаживали на 8-луночные планшеты, дно которых образовано покровным стеклом (Nunc Lab-Tek 8 well chambered coverglass, Thermo Scientific, США). Перед экспериментом инкубационная среда заменялась на раствор, состоящий из 9 частей среды МЕМ (HyClone, США), содержащей 20 мМ HEPES (HyClone, США), и одной части реагента Pluronic (Abcam Fluo-8 No Wash Calcium Assay Kit, Abcam, Англия), в котором были растворены Fluo-8 AM (Abcam Fluo-8 No Wash Calcium Assay Kit, Abcam, Англия) и NP-EGTA AM (Invitrogen, США). В каждую лунку добавляли Fluo-8 AM (3 мкМ) и NP-EGTA AM (3 м^), и клетки инкубировались 1 ч при 37°С. Затем клетки отмывались в среде MEM, содержащей HEPES (20 мМ). Съемку пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.