научная статья по теме КАЛЬЦИЙ-НЕЗАВИСИМАЯ РАЗОБЩАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ РЕГУЛИРУЕТСЯ ПОТОКАМИ ИОНОВ, ВЫЗЫВАЮЩИМИ ВЗАИМОПРЕВРАЩЕНИЯ И НА ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЕ Биология

Текст научной статьи на тему «КАЛЬЦИЙ-НЕЗАВИСИМАЯ РАЗОБЩАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ РЕГУЛИРУЕТСЯ ПОТОКАМИ ИОНОВ, ВЫЗЫВАЮЩИМИ ВЗАИМОПРЕВРАЩЕНИЯ И НА ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЕ»

УДК 577.23

КАЛЬЦИЙ-НЕЗАВИСИМАЯ РАЗОБЩАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ РЕГУЛИРУЕТСЯ ПОТОКАМИ ИОНОВ, ВЫЗЫВАЮЩИМИ ВЗАИМОПРЕВРАЩЕНИЯ АТ И АрН НА ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЕ

© 2014 г. В. Н. Самарцев*, М. В. Дубинин, С. И. Адакеева, С. Р. Рыбакова, Е. И. Марчик

Марийский государственный университет, пл. Ленина, 1, 424001 Йошкар-Ола *электронная почта: samvic56@mail.ru Поступила в редакцию 28.01.2014 г.

В опытах на митохондриях печени, энергизованных путем окисления сукцината, исследовано влияние потоков ионов через внутреннюю мембрану на кальций-независимое разобщающее действие пальмитиновой кислоты. В качестве индукторов потоков ионов использовали К+/Н+ антипортер нигерицин, вызывающий превращение на внутренней мембране АрН в разность электрических потенциалов (Ау); тетрафенилфосфоний (ТРР+), свободно пересекающий фосфолипидные мембраны; протонофор карбонилцианид-4-трифторметоксифенилгидразон (БССР), индуцирующий поток Н+ из межмембранного пространства в матрикс и снижающий Ау и АрН. Установлено, что нигерицин в концентрации 20 нМ частично подавляет способность пальмитиновой кислоты снижать Ау и стимулировать дыхание митохондрий. Специфический ингибитор ADP/АТР-антипортера (карбоксиатрактилат) и субстрат аспартат/глутаматного антипортера (глутамат) в присутствии пальмитиновой кислоты увеличивают Ау и частично ингибируют дыхание митохондрий. При этих условиях 10 мкМ циклоспорин А также ингибирует дыхание, но не влияет на Ау. Разобщающая активность пальмитиновой кислоты оценивалась количественно по увеличению скорости дыхания митохондрий, вызванное жирной кислотой, отнесенному к ее концентрации (удельная разобщающая активность, Уи); кроме того, оценивались три составляющие чувствительная к карбокси-атрактилату (КСа1г), чувствительная к глутамату (Р"01и) и чувствительная к циклоспорину А (КСкА). Показано, что нигерицин существенно уменьшает Уи, КСа1г и К01и, но увеличивает КСкА. ТРР+ в концентрации 20 мкМ увеличивает и К01и, не влияет на КСа1г и уменьшает КСкА. БССР в концентрациях 20 и 40 нМ, снижая Ау не более чем на 17%, не влияет на Уи, КСа1г, У01и и КСкА. На основании результатов мы предполагаем, что кальций-независимое разобщающее действие пальмитиновой кислоты в митохондриях печени обусловлено, помимо возвращения протонов в матрикс при участии ADP/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров, еще и активацией циклоспорин А-чувствительно-го транспорта электронов по дыхательной цепи без снижения Ау. Потоки ионов через внутреннюю мембрану митохондрий могут служить фактором регуляции кальций-независимой разобщающей активности пальмитиновой кислоты при участии ADP/ATP антипортера, аспартат/глутаматного антипортера и системы циклоспорин А-чувствительного транспорта электронов.

Ключевые слова: митохондрии, пальмитиновая кислота, кальций-независимое разобщение.

Б01: 10.7868/80233475514030062

ВВЕДЕНИЕ

Митохондрии животных — не только высокоэффективные энергетические станции, вырабатывающие АТР и тепло, но и основные продуценты активных форм кислорода (АФК) в клетке [1—3]. Одним из путей снижения продукции АФК в митохондриях является усиление протонной проводимости внутренней мембраны (индукция "мягкого" разобщения) с помощью разобщителей окислительного фосфорилирования [1, 5, 6]. Действие протонофорных разобщителей в митохондриях приводит к стимуляции дыхания и к снижению

обеих составляющих разности электрохимических потенциалов ионов водорода: трансмембранной разности электрических потенциалов (Ау) и трансмембранной разности концентраций ионов водорода (АрН) [1, 5—7]. Природными "мягкими" разобщителями окислительного фосфорилирования, способными снижать генерацию АФК в митохондриях, являются длинноцепочечные свободные жирные кислоты [1, 5, 8, 9]. Показано, что вызванное с помощью проникающего катиона доде-цилтрифенилфосфония повышение протонофор-ной разобщающей активности пальмитиновой

кислоты — одной из наиболее распространенных природных жирных кислот — приводит к усилению ее способности подавлять генерацию АФК в митохондриях [9]. Механизмы, лежащие в основе регуляции разобщающего действия жирных кислот, пока недостаточно исследованы.

В митохондриях печени при условии отсутствия в среде инкубации ионов кальция разобщающая активность предельных монокарбоновых жирных кислот (пальмитиновой и лауриновой) на 70—80% осуществляется по протонофорному механизму при участии белков-переносчиков внутренней мембраны, осуществляющих обменный транспорт ADP на АТР (ADP/ATP антипортер) и аспартата на глутамат (аспартат/глутаматный антипортер) [5, 10—13]. Специфический ингибитор ADP/АТР-антипортера карбоксиатрактилат и субстраты аспартат/глутаматного антипортера глута-мат (или аспартат) аддитивно и независимо друг от друга ингибируют такое кальций-независимое разобщающее действие жирных кислот, т.е. проявляют ресопрягающий эффект [10—13]. Меньшая часть кальций-независимой разобщающей активности жирных кислот (20—30%) осуществляется по неизвестному механизму и подавляется циклоспорином А в высокой концентрации [14, 15].

Согласно одной из гипотез, ADP/АТР- и ас-партат/глутаматный антипортеры содействуют переносу аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, в то время как последующее перемещение недиссоциированной формы жирной кислоты через фосфолипидный бислой осуществляется без участия белков по механизму флип-флоп [1, 5, 10, 16]. Из этой гипотезы следует, что процесс разобщающего действия жирных кислот при участии этих переносчиков состоит из двух стадий: 1) зависимый от Ду перенос аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный; 2) зависимый от ДрН перенос протонов жирными кислотами в противоположном направлении [16]. Очевидно, что в этом случае на разобщающую активность жирных кислот будут оказывать влияние даже небольшие изменения Ду и ДрН. Согласно другой гипотезе, ADP/АТР- и аспартат/глутаматный ан-типортеры, наряду с переносом анионов жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, участвуют в их протонировании [5, 10, 12] и даже содействуют транспорту протониро-ванной формы в противоположном направлении [12]. В этом случае можно предположить, что разобщающее действие жирных кислот лимитируется транспортной активностью переносчиков и мало зависит от небольших изменений Ду и ДрН.

В модельных исследованиях для превращения ДрН в Ду широко используется К+/Н+-антипор-тер нигерицин, который в энергизованных митохондриях переносит Н+ из межмембранного про-

странства в матрикс в обмен на К+ [1, 11, 17—19]. Показано, что в митохондриях печени этот ионо-фор достигает своей оптимальной эффективности уже при концентрации 20 нМ (20 пикомоль на 1 мг белка митохондрий) [11, 19]. Это в несколько раз меньше содержания в этих митохондриях ADP/ATP-антипортера (60—100 пикомолей на 1 мг белка) [20] и некоторых других переносчиков [21]. Для превращения Ду в ДрН достаточно элек-трофоретически перенести через мембрану любой ион, кроме Н+ [1]. Наше внимание привлек катион тетрафенилфосфония (ТРР+), растворимый в воде и способный пересекать фосфолипид-ные бислойные мембраны с небольшой сорбцией на их поверхности [22, 23]. Именно это свойство ТРР+ позволило широко использовать его для измерения Ду [22, 24, 25]. Известно, что добавление ТРР+ к митохондриям печени и сердца в концентрации на порядок превышающей ту, которая применяется для измерения Ду, приводит к усилению разобщающего действия жирных кислот [12, 26, 27]. Протонофорный разобщитель FCCP вызывает заметное снижение Ду и ДрН уже при его содержании в митохондриях около 20 пико-моль на 1 мг белка, что также существенно меньше содержания участвующих в разобщающем действии жирных кислот переносчиков анионов [20] и комплексов дыхательной цепи [7].

В настоящей работе предполагается выяснить, как изменится разобщающее действие пальмитиновой кислоты в митохондриях печени крыс под влиянием индуцированных ионных потоков через внутреннюю мембрану и связанных с этим изменений Ду и ДрН. Ионные потоки предусмотрено индуцировать с помощью: а) К+/Н+-антипор-тера нигерицина, вызывающего в митохондриях превращение ДрН в Ду; б) катиона ТРР+, свободно проникающего через фосфолипидную мембрану и способного превращать в митохондриях Ду в ДрН; в) протонофорного разобщителя FCCP, снижающего в митохондриях ДрН и Ду.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опыты проводили на митохондриях, выделенных из печени белых половозрелых самцов крыс (весом 210—250 г) общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью фракции V бычьего сывороточного альбумина (БСА), как подробно описано ранее [11]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозы, 1 мМ EGTA, 5 мМ MOPS (рН до 7.4 доводили трис(оксиметил)аминометаном). Концентрацию белка митохондрий определяли би-уретовым методом, в качестве стандарта использовали раствор БСА. Во время проведения эксперимента суспензию митохондрий (60—70 мг митохондриального белка в 1 мл) хранили на льду.

Дыхание митохондрий регистрировали полярографическим методом при 25°С в термостатиру-емой ячейке объемом 1 мл. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозы, 20 мМ KCl, 5 мМ янтарной кислоты, 0.5 мМ EGTA, 2 мМ MgCl2, 10 мМ MOPS (рН до 7.4 доводили трис(оксиметил)ами-нометаном).

Ду на внутренней мембране митохондрий оценивали по распределению катионов ТРР+, концентрацию которых регистрировали ТРР+-чув-ствительным электродом [24] при 25°С при постоянной аэрации и перемешивании с помощью магнитной мешалки в открытой ячейке объемом 2 мл. В этих экспериментах в указанную выше среду инкубации дополнительно добавляли 1.6 мкМ ТРР+. Значение Ду рассчитывали с учетом не-энергозависимого связывания ТРР+ с митохондриями по уравнению Нернста [24]. Объем мат-рикса, оцениваемого как среднее значение недоступного для сахарозы объема митохондрий печени [28], приводился к уровню 1 мкл/мг белка.

Разобщающее действие пальмитиновой кислоты оценивали по способности стимулировать дыхание митохондрий [29]. В полярографическую ячейку сразу после митохондрий добавляли ротенон (2 мкМ) и олигомицин

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком