НЕИРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 4, с. 328-334
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.821.6+615.27
КАРНОЗИН ф-АЛАНИЛ^-ШСТИДИН) ПОВЫШАЕТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОБУЧЕНИЯ В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА, СВЯЗАННОГО С ВЫРАБОТКОЙ УСЛОВНОГО РЕФЛЕКСА С ОТРИЦАТЕЛЬНЫМ ПОДКРЕПЛЕНИЕМ
© 2014 г. С. Л. Стволинский1, *, Т. Н. Федорова1, Д. С. Бережной2, А. А. Логвиненко1,
О. А. Музычук1, А. Н. Иноземцев2
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр неврологии" Российской академии медицинских наук, Москва 2Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова", биологический факультет, Москва
Ранее на моделях in vivo было показано, что гистидинсодержащий дипептид карнозин ф-аланил-L-гистидин) обладает способностью подавлять развитие в мозге окислительного стресса, вызванного такими воздействиями, как гипоксия, ишемия, введение нейротоксинов. При этом было обнаружено, что животные, перенесшие окислительный стресс на фоне введения карнозина, сохраняют навыки, полученные при обучении в открытом поле, норковой камере, водном лабиринте Морриса. В представляемой работе было исследовано влияния карнозина на когнитивные процессы в мозге в условиях, не связанных с воздействием повреждающих факторов. Введение карнозина предотвращало рост липидных гидроперекисей и повышало антиоксидантный статус мозга крыс в процессе выработки рефлекса активного избегания в челночной камере. В этих условиях было отмечено ускорение формирования навыка и увеличение доли успешно обучившихся животных. При этом в мозге крыс, получавших карнозин, повышался уровень глутамина — основной медиаторной аминокислоты, связанной с функцией пластичности мозга. Полученные результаты указывают на наличие у карнозина ноотропных свойств.
Ключевые слова: мозг, окислительный стресс, антиоксиданты, обучение, карнозин, глутамат, аспартат.
Б01: 10.7868/81027813314040098
ВВЕДЕНИЕ
Снижение когнитивных функций мозга при старении организма и заболеваниях ЦНС связано с нарушением интегративных познавательных процессов мозга, ухудшением памяти и снижением уровня бодрствования и устойчивости мозга к вредным воздействиям [1—4]. Эти изменения обусловлены нарушением энергетических процессов, микроциркуляции и кровоснабжения мозга [5]. Ведущую роль в повреждении и гибели ткани мозга в условиях гипоксии/ишемии и ней-родегенеративных заболеваний играет окислительный стресс (ОС), сопровождающийся повышением уровня свободнорадикальных соединений различной природы с одновременным снижением антиоксидантного статуса организма [6]. Нарушение редокс-статуса обусловливает це-
*Адресат для корреспонденции: 125367, Москва, Волоколамское шоссе, д. 80; тел. (495)490-24-09; е-шаП: slstvolinsky@mail.ru.
лесообразность применения препаратов антиок-сидантного действия.
Одним из перспективных соединений является природный нейропептид карнозин, обладающий широким спектром биологических свойств: антиоксиданта, протонного буфера, хелатора металлов с переменной валентностью, антиглики-рующего агента, иммуностимулятора [7]. В мозге карнозин присутствует в глиальных клетках и в некоторых типах нейронов [8, 9].
На различных экспериментальных моделях, характеризующихся окислительными повреждениями мозга — иммобилизационный и электроболевой стресс, острая гипобарическая гипоксия, ишемия головного мозга, гипергомоцистеине-мия, МРТР-индуцированный паркинсонизм -было установлено антиоксидантное и нейропро-текторное действие карнозина [10—20]. Защитные эффекты карнозина проявлялись не только в поддержании эндогенного антиоксидантного статуса, но и в уменьшении объема очагов ише-
мического поражения, и в обеспечении сохранности двигательной активности животных и долговременной памяти, выявляемых в таких тестах, как открытое поле, норковая камера, водный лабиринт Морриса [21—26]. Введение карнозина в комплексное лечение пациентов с БП и хронической сосудистой патологией головного мозга (дисциркуляторной энцефалопатией) приводило к позитивной динамике неврологической симптоматики и улучшению когнитивных функций [27, 28]. Хорошие результаты когнитивного тестирования были получены в недавно проведенном клиническом исследовании (randomized double blind placebo controlled) по применению кар-нозина для реабилитации ветеранов войны в Персидском заливе [29].
Свойства карнозина, выявленные в модельных экспериментах и клинических исследованиях, близки к спектру действия ноотропных препаратов. В то же время сведения о влиянии карнози-на на процессы выработки животными сложных поведенческих реакций в условиях, не связанных с воздействием повреждающих факторов, в литературе не представлены. Для оценки влияния карнозина на когнитивные процессы в мозге нами был использован метод выработки условного рефлекса активного избегания [30].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные и введение препаратов. Эксперименты проводились на 80-дневных крысах самцах линии Вистар (масса тела 280—300 г), которые содержались в контролируемых условиях вивария при 12 ч световом цикле. У животных был свободный доступ к корму и воде. Все эксперименты проводились в соответствии с международными правилами по работе с лабораторными животными "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals". Крысы были разделены на три группы: животные группы 1 (интактная, n = 10) не участвовали в экспериментах по обучению; животные группы 2 (экспериментальная, n = 7) ежедневно получали внутрибрюшинно раствор карнозина (100 мг/мл) из расчета 1 мл/кг массы тела в каждом опыте за 1 ч до помещения животных в челночную камеру; животные группы 3 (контрольная, n = 9) получали на таких же условиях эквивалентный объем физиологического раствора. Животные экспериментальной и контрольной групп в течение 8 дней обучались реакции активного избегания в челночной камере. Через 1 ч после заключительного опыта животных обеих групп декапитировали, структуры мозга (гипоталамус, кора) извлекали на льду и замораживали в жидком азоте для проведения биохимических исследований. Животных интактной группы дека-питировали независимо от сроков эксперимента.
Карнозин был получен от компании Hamari Chemicals, Ltd, Япония.
Постановка реакции избегания в челночной камере. Реакция избегания в челночной камере широко используется для изучения способности экспериментальных животных к обучению [31, 32]. Экспериментальная среда состоит из двух отсеков с электрифицированным полом, соединенных перегородкой с дверцей. На стенках обоих отсеков расположены устройства для подачи условных стимулов — световых сигналов. Каждые 30 секунд в отсек, в котором находится животное, подается световой сигнал, через 10 с действия сигнала на пол этого отсека подается электрический ток (10 с), который можно избежать, перейдя в другой отсек. Число таких сочетаний стимулов (далее — проб) составляет в каждом опыте 20, продолжительность обучения — 8 дней. Задача животного — установить связь между включением условного стимула (света) и безусловного (тока) и выработать реакцию избегания в ответ на световой сигнал. В каждом опыте регистрировали долю реакций избегания от общего числа проб, в качестве критерия выработки навыка рассматривали стабильное воспроизведение животными реакции избегания на уровне 75% от количества проб в опыте.
Характеристика окислительного статуса ткани мозга. Состояние окислительного статуса ткани мозга (перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной системы) определяли методом измерения железо-индуцированной хе-милюминесценции, сопровождающей свободно-радикальные процессы [21]. Для исследования использовали 10%-ный гомогенат коры головного мозга экспериментальных животных, приготовленный в фосфатном буфере (рН 7.45, 60 мМ KH2PO4, 105 мМ КС1). В кювету вносили 0.1 мл гомогена-та, 0.8 мл фосфатного буфера, помещали ее в измерительную камеру люминометра и при температуре 37°C снимали показания фоновых величин. Для инициирования хемилюминесценции вводили с помощью диспенсера 0.1 мл 25 мМ раствора двухвалентного железа (Fe2SO4 • 7Н2О). В ответ на добавление железа происходит быстрая вспышка хемилюминесценции (h, мВ/у.е.), ее интенсивность характеризует уровень предобразо-ванных продуктов ПОЛ (преимущественно гидроперекисей липидов). Далее наступает латентный период (т, с/у.е.), свидетельствующий о резистентности ткани мозга к дальнейшему окислению. По длительности латентного периода судят об антиоксидантном эндогенном потенциале: большая длительность лаг-периода указывает на более высокий уровень в исследуемой пробе суммарных антиоксидантов. По окончании латентного периода начинается фаза медленного нарастания ХЛ (Н, мВ/у.е.), связанная с дальнейшим окислением ионов двухвалентного железа и на-
33
Контроль
Карнозин
Рис. 1. Результаты обучения животных в челночной камере (заключительное тестирование). На диаграмме представлено количество животных в процентах от численности группы: светло-серая зона — животные, достигшие критерия, равного 75% реакций избегания в опыте; темно-серая зона — животные, вероятность избегания у которых находилась в пределах от 50% до 75%; не заштрихованная зона — животные не обучились. Звездочками отмечена достоверность отличий по критерию согласия частот с р < 0,05.
коплением продуктов ПОЛ. Интенсивность ХЛ нарастает постепенно, достигает своего максимума и затем начинает снижаться до величины стационарного свечения. Величина этого параметра ХЛ отражает способность субстрата к окислению, максимально возможную интенсивность ХЛ.
Измерение ХЛ проводили на приборе Lumi-nometer-1251 (LKB, Швеция) в 2 параллельных пробах для каждого образца, используя в анализе среднюю величину.
Определение содержания аминокислот. Содержание аминокислот определяли в гомогенате гипоталамуса экспериментальных животных с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, USA) с аналитической колонкой Phenomenex (C18, 4 х 150 mm, 4 mcM). Измеряли содержание медиаторных аминокислот: глутамата и аспарта-та. Перед экс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.