ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 460-465
УДК 663.12
КАРОТИНОИДЫ И ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ В КРАСНЫХ ДРОЖЖАХ
Sporobolomyces roseus И Rhodotorula glutinis
© 2004 г. П. Даволи*, В. А. Мирау**, Р. В. С. Вебер**
*Кафедра химии, Университет г. Модены, 41100 Модена, Италия **Кафедра биотехнологии, Университет г. Кайзерслаутерна, 67663 Кайзерслаутерн, Германия,
e-mail: rwsweber@rhrk.uni-kl.de.
Поступила в редакцию 27.07. 2003 г.
Показано, что изменение режима аэрации при культивировании Rhodotorula glutinis и Sporobolomyces roseus приводило к изменению состава и количества синтезируемых каротиноидов. При повышенной аэрации концентрация каротиноидов в клетках R. glutinis возрастала как в расчете на биомассу, так и по отношению к жирным кислотам, но при этом состав оставался без изменения: тору-лин > в-каротин > у-каротин > торулародин. В отличие от R. glutinis, S. roseus в условиях повышенной аэрации синтезировал больше в-каротина, чем торулина и торулародина, за счет переключения биосинтеза каротиноидов в точке разветвления у у-каротина. Общий уровень каротиноидов при повышенной аэрации составил 0.55 и 0.50 моль % по отношению к содержанию жирных кислот, 206 и 412 мкг/г сухой биомассы у R. glutinis и S. roseus соответственно.
Красные дрожжи - это группа не родственных организмов (в основном базидиальные грибы), которые обитают в филоплане или на разлагающемся растительном материале. Продуцент ас-таксантина Phaffia rhodozyma (Miller 1976) относится к Heterobasidiomycetes, а Sporobolomyces roseus (Kluyver, van Niel 1924) и Rhodotorula glutinis (Fresenius 1863, Harrison 1928) принадлежат к Ure-diniomycetes, то есть к ржавчинным грибам и близким к ним родам [1]. Третья отдельная группа красных дрожжей родственна Ustilaginomyce-tes - головневым грибам.
Красные дрожжи могут в значительных количествах образовывать каротиноиды в среднем 50-350 мкг/г сухих клеток, как, например, дикий штамм Rhodotorula spp. [2, 3]. Каротиноиды у дрожжей и других грибов обычно содержатся в липидных каплях [4, 5]. Несмотря на то, что их физиологическая роль окончательно не определена, существуют доказательства того, что они выполняют функции антиоксидантов. Филоплан, как типичная среда обитания красных дрожжей, подразумевает воздействие уФ-облучения. Исследования, проведенные на мутантах или с ингибиторами биосинтеза показали, что штаммы с недостатком каротиноидов очень чувствительны к перекисным радикалам или оксидантам, и эта чувствительность может быть снижена добавкой экзогенных каротиноидов [6]. Кроме того, синтез каротиноидов подвержен влиянию образующихся свободных радикалов [7], аэрации [8] и освещения [9]. Их антиоксидантное действие реализуется посредством двух механизмов: энергия синг-летного кислорода может рассеиваться в виде тепловой, при этом структура молекулы кароти-
ноида не изменяется, взаимодействие же с пере-кисными радикалами сопровождается разрушением молекулы [10].
Ранее было показано, что аэрация незначительно влияла на состав каротиноидов у Rhodo-ЮтШ spp, хотя общий уровень синтеза увеличивался и часто был выше необходимого для оптимального роста дрожжей [8, 11]. Представители рода Sporobolomyces, обычные представители ми-кофлоры воздуха и поверхности листьев большинства видов растений, мало изучены, поэтому были использованы в качестве объекта в настоящей работе. Результаты предыдущих исследований [4] показали стимулирование синтеза каротиноидов при повышенном уровне аэрации.
Два использованных нами филогенетически родственных вида дрожжей по-разному отвечали на изменение условий аэрации. Для изолирования и идентификации каротиноидов были использованы методы ИРЬС и ИРЬС-МБ. Эти же методы позволили определить у-каротина отдельно от Р-каротина.
Цель работы - изучение состава и количества синтезируемых & roseus и R. glutinis каротиноидов при различных режимах аэрации, а также соотношения каротиноидов и жирных кислот.
МЕТОДИКА
Штам Rhodotorula glutinis var. dairenensis, (Hase-gawa, Banno 1958, ATCC 26085) был приобретен в коллекции "American Type Culture Collection", штамм S. roseus (D99040) - из коллекции культур
кафедры биотехнологии университета Кайзер-слаутерна.
Хранение дрожжей осуществлялось на агари-зованной среде с 2%-ным солодовым экстрактом. Культивирование проводили на жидкой среде следующего состава (г/л): глюкоза - 30, дрожжевой экстракт - 4.0, KH2PO4 - 1.0, MgSO4 ■ 7H2O - 0.5, в колбах Эрленмейера со 150 мл среды. Колбы закрывались рыхлой ватной пробкой для обеспечения доступа воздуха. Для изучения влияния аэрации изпользовались стандартные колбы Эрленмейера и колбы с отбойниками. Выращивание проводили на качалке (120 об./мин) в течение 108 ч при 24°C. При дальнейшей инкубации биомасса не увеличивалась, образование каротинои-дов прекращалось. Биомассу определяли весовым методом после отделения клеток центрифугированием и высушивания в течение 24 ч при 80°C. Каждый эксперимент проводился трижды, рассчитывали среднее арифметическое и абсолютное отклонение.
После окончания выращивания клетки отделяли центрифугированием 10 мин при 12000 g, отмывали равным объемом дистиллированной воды. Внутриклеточные липиды и каротиноиды экстрагировали 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) при оттаивании замороженных клеток дрожжей в течение 12 ч в темноте при комнатной температуре [12]. После центрифугирования фракцию ДМСО собирали, а осадок ресуспензировали в 20 мкл ацетона, снова центрифугировали, фракции объединяли. Экстракцию повторяли до тех пор, пока осадок не обесцвечивался. Собранный таким образом экстракт (~100 мл) смешивали с равным объемом петролейного эфира (температура кипения 45-75°C), добавляли 50 мл дистиллированной воды и 5-10 мл насыщенного раствора NaCl для образования двух фаз. Пигментированную верхнюю фазу отмывали три раза дистиллированной водой и упаривали досуха. Для анализа ка-ротиноидов методом HPLC осадок растворяли в 0.5 или 2 мл ацетона, для анализа липидов - в 0.5, 1.0 или 2.0 мл н-гексана.
HPLC проводили на приборе HP 1090 Series II ("Hewlett Packard", Германия), на хроматографи-ческой колонке с обращенной фазой (LiChrospher 100 RP-18, 250 х 4 мм; "Merck", Германия). Объем пробы 10 мкл, при скорости потока 1 мл/мин. Использовали элюирование градиентом вода/ацетон (B/A) [13], начиная с 70% и до 100% А за 15 мин, затем 2 мин при 100% A. Количественное содержание каротиноидов рассчитывали, вычисляя площадь пика пигментов на HPLC по отношению к площади пиков калибровочных стандартов.
Р-Каротин предоставлен фирмой "Sigma" (США), торулародин экстрагирован из Rhodotorula mucilaginosa (Jorgensen) Harrison 1928 следующим образом: экстракт, полученный, как описанно
выше, наносили на силикатный гель, элюировали смесью циклогексан-этилацетат (95 : 5) для извлечения неполярных каротиноидов. Элюцию оставшейся адсорбированной красной полоски проводили смесью циклогексан-этилацетат (60 : 40), единственным компонентом которой, как показал анализ HPLC, был торулародин. После того, как количественное содержание торулародина было определено спектрофотометрическим методом, проба использовалась для приготовления стандартов для калибровочной кривой при 500 нм. Калибровочные кривые для у-каротина и торулародина строились при 450 нм, как было опубликовано ранее [14, 15].
Идентификация четырех пигментов в дрожжевых экстрактах была подтверждена на масс-спектрометре "Hewlett-Packard" Series 1100LC-MSD в режиме химической ионизации при атмосферном давлении. Масс-спектромерию проводили в условиях, описанных в [15], за исключением градиентного элюирования смесью вода-ацетон, которое было применено, как описано выше для HPLC.
Для газовой хроматографии неочищенные экстракты (200 мкл) этерифицировали в закрытом сосуде в свежеприготовленном растворе ме-тилата натрия (100 мкл) в метаноле. [15]. Метил-10-ундеканоат (100 мкл исходного раствора 10 мг/мл в н-гексане) был использован в качестве стандарта для количественного анализа. Состав и концентрация полученных в результате сложных метиловых эфиров жирных кислот определяли методом газовой хроматографии и масс-спектромет-рии на хроматографе "Hewlett Packard" 5890 Series II, соединенном с масс-спектрометром HP5989A [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Культуры дрожжей, выращенные в колбах с отбойником, были окрашены более интенсивно по сравнению с культурами в стандартных колбах, что показало влияние аэрации на состав и/или концентрацию каротиноидов. Наблюдалось также умеренное увеличение биомассы: 6.31 ± 0.47 мкг/мл для стандартных колб и 9.01 ± 0.34 мкг/мл для колб с отбойником у R. glutinis, и 4.82 ± 0.34 и 9.3 ± 1.5 мкг/мл соответственно у S. roseus. Для количественной оценки изменений проведен анализ HPLC, результаты которого представлены на рис. 1 и в табл. 1. В экстрактах из клеток культуры R. glutinis суммарная концентрация четырех пигментов возросла по отношению к биомассе 1.3-2.8 раза (рис. 1a, табл. 1). В экстрактах из клеток S. roseus, выращенных в колбах с отбойниками, наблюдалось также значительное увеличение концентрации то-рулина, торулародина и у-каротина (в 5.7-10.2 раз в расчете на 1 г сухой биомассы) и небольшое увеличение (в 1.4 раза) ß-каротина (рис. 16, тaбл. 1). В процентном отношении содержание торулина, торулародина и у-каротина возросло за счет ß-ка-
^450
500 400 Ь
18 мин
Рис. 1. HPLC пигментов R. glutinis (a) и S. roseus (б), выращенных в стандартных колбах (I) и колбах с отбойниками (II). Объем пробы - 10 мкл экстракта из 1.5 мл культуры. 1 - торулародин, 2 - торулин, 3 -у-каротин, 4 - ß-каротин.
ротина у 5. твБвт, тогда как у Я. glutinis значительных изменений в соотношении пигментов не наблюдалось (рис. 2). Результаты идентификации этих четырех пигментов были подтверждены масс-спектрометрией с молекулярными ионами
m/z 536 (ß- и у-каротина), 534 (торулина) и 564 (то-рулародина).
При различных режимах аэрации содержание жирных кислот оставалось неизменным как у R. glutinis, так и S. roseus (табл. 2). Доминирующими кислотами были олеиновая и линолевая (C18 : 1 и C18 : 2; 60.2-72.1%) за ними следовали пальмитиновая (C1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.