НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 3, с. 200-206
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612:822.3
КАСПАЗА-3 И КАЛПАИН: РАЗНОНАПРАВЛЕННОЕ УЧАСТИЕ В ПРЕСИНАПТИЧЕСКОЙ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ © 2014 г. И. В. Кудряшова*, М. В. Онуфриев, Н. В. Гуляева
Федеральное Государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской Академии наук, Москва
В поле СА1 переживающих срезов гиппокампа крыс исследовали влияние протеолитических ферментов каспазы-3 и калпаина на динамику LTP-зависимых модификаций парной пластичности. Измерение парной фасилитации (PPF) производилось в течение часа после высокочастотного раздражения коллатералей Шаффера (100 Гц, 1 с). При индукции LTP обнаружено достоверное снижение PPF, в отсутствие LTP после тетанизации снижения PPF не было. Через час после тетанизации остаточное отклонение PPF достоверно коррелировало с эффективностью поддержания LTP. По окончании эксперимента в тех же срезах измеряли активность каспазы-3 и калпаина. Потенциация редко возникала при низкой активности обоих ферментов и чаще всего заканчивалась депрессией. Независимо от того, какая из протеаз была активна, вероятность индукции LTP увеличивалась, однако вероятность долговременного сохранения модификаций была достоверно выше при высокой активности каспазы-3, но не калпаина. Высокая активность обеих протеаз (одновременно) не влияла на вероятность индукции, но в этом случае сохранение LTP было хуже, чем при высокой активности только каспазы-3. Эффект LTP-зависимого долговременного снижения PPF преобладал в срезах с высокой активностью каспазы-3. В отличие от этого, при высокой активности калпаина снижение PPF было менее существенным и кратковременным. При низкой активности калпаина наблюдалось устойчивое снижение PPF на фоне LTP. Оба эти эффекта исчезали при высокой активности обеих протеаз; потенциация в этих срезах сопровождалась постепенным увеличением PPF, без первоначального снижения. При трехфакторном анализе обнаружено достоверное взаимодействие факторов "каспаза-3"—"калпаин"—"сохранность LTP". Полученные результаты дают основание полагать, что каспаза-3 способствует, а калпаин препятствует сохранению пресинаптических механизмов пластичности. Специфичность эффектов протеаз может быть связана с разными локу-сами пластичности или конкурентным взаимодействием в зоне пресинапса.
Ключевые слова: переживающие срезы гиппокампа, долговременная потенциация, парная фасилитация, каспаза-3, калпаин.
Б01: 10.7868/81027813314030091
К настоящему времени обнаружено несколько принципиально разных механизмов, способных поддерживать эффективное состояние синапса в течение достаточно длительного времени. Некоторые из них могут сосуществовать в разных ло-кусах одного и того же синапса. В силу методических ограничений, основное внимание уделяется постсинаптической пластичности, тогда как исследования пресинаптических механизмов представлены отдельными группами авторов [1]. Для определения пресинаптической или постсинап-тической локализации механизмов долговременной пластичности используется метод парной стимуляции [2—6].
Считается, что синаптическая потенциация, которая сопровождается снижением парной фа-
* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а, e-mail: iv_kudryashova@mail.ru.
силитации (PPF), может свидетельствовать об увеличении пресинаптического высвобождения медиатора [2, 3, 7]. Очевидное снижение PPF характерно лишь для некоторых структур [1]. В гип-покампе пресинаптические механизмы являются основой долговременной потенциации мшистых волокон поля СА3 [8]. В поле СА1 пресинаптические модификации хорошо заметны в самом раннем возрасте, в синапсах с очень низкой эффективностью высвобождения медиатора [9]. У взрослых животных в фазе поддержания LTP в поле СА1 может сопровождаться как снижением, так и увеличением PPF [2], за исключением лишь некоторых достаточно специфических протоколов индукции [10]. Предполагается, что в основе поддержания LTP лежат как пресинаптические, так и постсинаптические механизмы. От их соотношения могут зависеть индивидуальные особенности изменения PPF.
Известно, что в ходе консолидации наблюдается увеличение протеолитической активности [5, 11—14]. К ферментам, участвующим в долговременной пластичности, относятся цистеино-вые протеазы [15, 16]. Каспаза-3 [15] и калпаин [17] являются Са2+-зависимыми ферментами, реагирующими, в частности, на активацию NMDA рецепторов [15, 18]. Эти ферменты имеют как общие, так и разные субстраты [15] и, следовательно, конечный результат модификаций может видоизменяться в соответствии с долей их участия. В данных экспериментах было обнаружено, что при действии одних и тех же сигналов, индуцирующих долговременную пластичность, для эффективной консолидации достаточно активации лишь одной из этих протеаз. Более того, длительность поддержания LTP в поле СА1 переживающих срезов гиппокампа существенно сокращалась при их совместной активации [19].
Специфический паттерн активации протеаз может, по-видимому, объясняться компартмента-лизацией их функций в долговременной пластичности. Для определения особенностей участия каспазы-3 и калпаина в пресинаптических модификациях использовался PPF-тест.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Электрофизиологические эксперименты проводили на переживающих срезах гиппокампа крыс Вистар массой 90—180 г. Состав перфузион-ной среды (мМ): NaCl 124; KCl 5; MgSO4 • 7H2O 1.3; CaCl2 2.5; NaH2PO4 1; NaHCO3 26; D-глюкоза -10; карбоген - 95% O2 и 5% CO2; pH 7.3-7.4, температура 32°С. Регистрацию суммарной электрической активности проводили в поле СА1 стеклянным микроэлектродом, заполненным 0.33 M раствором хлористого натрия. Раздражающие биполярные электроды устанавливали в радиальном слое на коллатерали Шаффера. Для индукции LTP применяли высокочастотное раздражение коллатералей Шаффера 100 Гц, 1 с. До и в течение 1 ч после тетанизации тестирование моносинап-тических фокальных потенциалов в течение всего времени регистрации проводили парными стимулами с межстимульным интервалом 70 мс. Измеряли фокальные ВПСП первого и второго в паре ответа и их соотношение (PPF).
Сразу после тестирования срезы замораживали при температуре —70°С. Активность каспазы-3 или калпаина определяли в каждом отдельном срезе флюориметрическим методом. Для определения активности каспазы-3 пробы инкубировали 60 мин при 37°С в реакционном буфере, содержащем 150 мМ HEPES, pH 7.4, 15% сахарозы, 15 мМ дитиотрейтола, 0.15%-CHAPS (все — Sigma, США), 1 мМ ЭДТА в двух параллельных образцах, один из которых содержал 50 мкМ N-ацетил-
Асп-Глу-Вал-Асп-7-амино-4-трифторметилкума-рин (Ac-DEVD-AMC, флюорогенный субстрат каспазы-3, Biomol, США), а другой 50 мкМ ^ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-7-амино-4-метилку-марин и 5 мкМ N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-СНО (Ac-DEVD-CHO, конкурентный ингибитор кас-пазы-3, Biomol, США), конечная концентрация белка составляла 0.5 мг/мл. Флуоресценцию регистрировали при длинах волн возбуждения и эмиссии 400 нм и 490 нм соответственно на спек-трофлуориметре Hitachi F-3000, оборудованном микрокюветой. Активность каспазы-3 рассчитывали по разности скоростей накопления свободного 7-амино-4-метилкумарина в пробах, содержащих и не содержащих специфический ингибитор каспазы-3, и выражали в пмоль/мин/мг белка. В качестве флюоресцентного стандарта использовали 7-амино-4-метилкумарин (Sigma, США). Определение активности калпаина проводили флюориметрическим методом с использованием синтетического субстрата suc-LLVY-AMC ^-сукцинил-Лей-Лей-Вал-Тир-7-амино-4-метил-кумарин). Для определения активности калпаина пробы инкубировали 60 мин при 37°С в реакционном буфере, содержащем 20 мМ трис/HCl, рН 7.4, 5 мМ CaCl2, 1 мМ ДТТ, 50 мкМ suc-LLVY-AMC, конечная концентрация белка составляла 0.5 мг/мл. Для определения специфичности расщепления субстрата Сa2+-зависимым калпаином в параллельный образец вносили все компоненты кроме 5 мМ CaCl2 и по 10 мМ ЭДТА и ЭГТА. Флуоресценцию образовавшегося АМС регистрировали, как описано выше. Активность калпаина рассчитывали по разнице скоростей расщепления suc-LLVY-AMC в образцах в присутствии Сa2+ или хелаторов Сa2+.
Влияние факторов индукции и поддержания LTP, а также активации протеолитических ферментов оценивали с помощью ANOVA.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для исследования динамики изменения свойств СА1 парной пластичности после высокочастотного раздражения коллатералей Шаффера было использовано 22 среза. Измерение PPF в данных экспериментах проводилось каждые 5 мин в течение часа после высокочастотного раздражения коллатералей Шаффера (100 Гц, 1 с). В целом результаты этих экспериментов подтверждают факт снижения парной фасилитации при индукции LTP Подавляющее большинство срезов реагировало снижением PPF практически сразу после индукции LTP. Если рассматривать всю выборку в целом, достоверное снижение PPF наблюдалось сразу после тетанизации (рис. 1). Вместе с тем, на этом рисунке заметна явная тенденция к восстановлению средних значений PPF
202 PPF
2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2
1.0
10 20 30 40 50 Время после тетанизации, мин
dPPF
0.2
0
-0.2 -0.4 -0.6 -0.8
dPPF 0.4
0.2
10 20 30 40
50
И
Время, мин б
Рис. 1. Снижение PPF (ось ординат) в поле СА1 переживающих срезов гиппокампа крыс после высокочастотного раздражения (100 Гц, 1 с) коллатералей Шаффера. На всех рисунках по оси абсцисс - время после тетанизации. Представлены средние значения по всем срезам (n = 22). Здесь и на других рисунках пунктиром отмечен момент тетанизации. Звездочки обозначают достоверность отличий от исходного уровня.
в фазе поддержания LTP. Оказалось, что процесс восстановления действительно зависит от времени, прошедшего после тетанизации (F = 2.42, p < 0.008), хотя через час PPF все еще достоверно ниже.
Следует отметить, что высокочастотное раздражение коллатералей Шаффера не всегда приводило к однозначным изменениям PPF во всех срезах. В некоторых опытах (5 срезов) после тета-низации не наблюдалось заметного прироста амплитуды ответа. На рис. 2 и 3 представлена динамика изменения PPF как процент отклонения от исходного уровня. Видно, что в от
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.