РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 2
= ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ =
КАТАЛИТИЧЕСКАЯ ПОЛИСПЕЦИФИЧНОСТЬ SIGA АБЗИМОВ ИЗ МОЛОКА ЛАКТИРУЮЩИХ ЖЕНЩИН
© 2009 г. С.Е. Седых, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской
академии наук, Новосибирск, Россия
Поступила: 06.10.2008. Принята: 12.05.2009
Ранее было показано, что молоко здоровых рожениц содержит sIgA антитела, гидро-лизующие ДНК, а также фосфорилирующие белки и липиды. В данной работе впервые показано, что гомогенные по данным электрофореза sIgA при хроматографии на ДНК-целлюлозе, АТР-сефарозе, казеин-сефарозе и сорбенте с иммобилизованными липидами при элюции с помощью различных концентраций соли распределяются в случае каждого сорбента по всему профилю хроматографии. При этом практически все полученные фракции, включая элюируемые в условиях разрушения сильных комплексов белков и ферментов со специфическими лигандами, а также комплексов антител с антигенами, проявляют высокую активность в гидролизе ДНК, фосфорилировании казеина и липидов. Полученные данные свидетельствуют в пользу каталитической полиспецифичности поликлональ-ных антител, которая может быть обусловлена как обменом HL компонентами легкой и тяжелой цепей между разными (HL)2 молекулами IgA антител, так и соединением с помощью секреторного компонента S и J-цепи абзимов с различными каталитическими свойствами при образовании (HL)2 — SJ-(HL)2 молекулы sIgA из двух молекул IgA. Такие механизмы образования sIgA могут привести к формированию молекул антител, имеющих в своем составе HL компоненты, обладающие от одной до четырех различных каталитических активностей.
Ключевые слова: sIgA абзимы, материнское молоко, каталитическая полиреактивность.
ВВЕДЕНИЕ
Антитела против химически стабильных аналогов переходных состояний, а также природные 1д с каталитическими активностями получили название абзимов и достаточно хорошо описаны в литературе (для обзора см. [1 — 6]). Согласно сложившимся представлениям, наличие в крови абзимов является четким признаком протекания в организме человека аутоиммунных процессов [2 — 6]. 1дС и/или 1дА, 1дМ антитела, гидролизующие ДНК, РНК, белки и полисахариды были обнаружены в крови пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями (АИЗ): СКВ, тиреоидит Хашимото, полиартрит, рассеянный склероз, лимфопролиферативные заболевания, злокачественные опухоли, а также
Адрес: 630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8; Институт химической биологии и фундаментальной медицины. E-mail: nevinsky@niboch.nsc.ru
Каталитическая полиспецифичность sIgA абзимов из женского молока
вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция (для обзора см. [2 — 6]).
Долгое время из-за отсутствия явной иммунизации существование природных абзимов у доноров без каких-либо патологий иммунного статуса считалось невозможным. Тем не менее, было показано, что кровь здоровых доноров может содержать абзимы, расщепляющие некоторые белки и полисахариды, активность которых на несколько порядков ниже, чем у пациентов с АИЗ [7 — 9]. Особой группой здоровых людей являются женщины, у которых в период беременности и сразу после родов есть склонность к протеканию аутоиммунных процессов, подобным таковым для пациентов с аутоиммунными заболеваниями ([10—11] и ссылки в них). Во время беременности кровь женщин (также как и кровь больных аутоиммунными заболеваниями) содержит ДНК в повышенных концентрациях, а также клетки плода в небольших концентрациях; установлена корреляция повышенной частоты встречаемости клеток плода в периферической крови матери с заболеваемостью АИЗ.
Первым примером абзимов здоровых по медицинским показаниям женщин были 81дЛ молока здоровых рожениц, катализирующие фосфорилирование казеина и ряда других белков молока [12]. Молоко оказалось уникальным источником абзимов как с типичными, так и уникальными ферментативными активностями. Было показано, что небольшие субфракции поликлональных 1дС и в1дЛ молока человека способны катализировать реакции гидролиза ДНК-, РНК [13—14], рибо- и дезокси-ЫМР, ^Р и ЫТР [11], а также отщепление 5'-концевого фосфата ДНК и РНК (фосфатазная активность) [13—14], гидролиз полисахаридов [9] и казеина [15]. В молоке здоровых рожениц были обнаружены в1дЛ и 1дС с уникальными липид- [16] и полисахарид-киназными [17] активностями, фосфорилирующие минорные липиды и полисахариды с ранее неописанной структурой.
В данной работе впервые сделана попытка анализа структуры 81дЛ абзимов с помощью хроматографии на разных аффинных сорбентах и последующего сравнения профилей различных каталитических активностей между собой, а также с профилями оптической плотности АТ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение антител
Электрофоретически и иммунологически гомогенные препараты 81дЛ были получены с помощью последовательных аффинных хро-матографий белков материнского молока на протеин С-сефарозе и протеин А-сефарозе в условиях разрушения неспецифических комплексов согласно [10—17].
Получение липид-сорбента
Жирную фракцию женского молока (200 мл) отделяли от плазмы центрифугированием в течение 2 ч при 3000 об/мин. Затем ее дважды промывали водой при интенсивном встряхивании для удаления водорастворимых компонентов и подвергали центрифугированию. Для экстракции липидов и жиров из жирной фракции была использована смесь хлороформ-метанол — 2:1 по объему, которая используется для экстракции липидов из биологических жидкостей. После удаления органических растворителей на ротацион-
ном испарителе, полученный осадок еще раз экстрагировали смесь хлороформ-метанол. Часть сухого остатка (1 г) после удаления растворителей суспендировали в воде и суспензию смешивали с 20 мл силикагеля, интенсивно встряхивали и затем отделяли от суспензии центрифугованием. Полученный липид-сорбент вносили в колонку, промывали 1 л воды и затем уравновешивали 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5.
Хроматография sIgA на аффинных сорбентах
Препараты sIgA, предварительно отдиали-зованные против 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, наносили на одну из аффинных колонок (8 мл ДНК-целлюлозы, 10 мл казеин-сефарозы, 7 мл АТР-сефарозы, 10 мл липид-сорбента), которые были уравновешены этим же буфером. Затем каждую из колонок промывали этим же буфером до исчезновения оптической плотности, элюцию АТ проводили последовательным пропусканием через колонку 20 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,5, содержащего 50, 150, и 3 М NaCl, а также 3 М MgCl2. В случае липид-сорбента АТ элюировали 150, и 1,2 М NaCl. Полученные фракции диализовали против 100 — кратного избытка буфера 20 мМ Трис-HCl , pH 7,5, после чего оценивали их относительную активность в реакциях гидролиза ДНК, а также фосфорилирования липидов и казеина (см. ниже).
Анализ ДНК-гидролизующей активности АТ
ДНКазную активность АТ определяли по степени уменьшения ДНК в полосе су-перскрученной ДНК плазмиды pBluescript при ее переходе в гидролизованные формы согласно [13—14]. Реакционную смесь (20 мкл), содержащую 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 10 мкг/мл ДНК и 5—100 мкг/мл АТ, инкубировали 3 мин при 37 °С. К реакционной смеси добавляли 5 мкл раствора, содержащего 0,1% красителя бром-фенолового синего, 50% глицерин, 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле (буфер для электрофореза: 40 мМ Трис-ацетат, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА). После проведения электрофореза ДНК окрашивали раствором бромистого этидия (0,5 мкг/ мл). Для обработки результатов использовали программу Image Quant.
Фосфорилирование липидов, связанных с АТ
Реакционная смесь (10 мкл) содержала: 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 3 мМ MgCl2, 0,05 — 0,2 мг/мл АТ, и 1 мкМ [y-32p]ATP с удельной активностью 0,2 МБк/ммоль согласно [16]. Смесь инкубировали при 370С в течение 1 ч, реакцию останавливали добавлением равного объема 10 % ТХУ, липиды экстрагировали смесью хлороформ: метанол — 2:1 (по объему). Липидную фракцию упаривали в вакууме на роторном испарителе и наносили на пластинки для ТСХ. Восходящую хроматографию ли-пидов проводили при комнатной температуре в системе хлороформ: метанол: вода — 14:6:1 (по объему), на пластинках Kiesilgel 60. Пластинки высушивали и подвергали радиоавтографии. Относительную активность фос-форилирования липидов определяли путем анализа радиоавтографов с помощью программы Image Quant.
Фосфорилирование казеина
Высокоочищенный казеин получали как описано ранее [15]. Реакционная смесь (20 мкл) содержала: 20 мМ трис-HCl, pH 6,8, 50 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 0,3 мМ ЭДТА , 0,54 мг мл/мл казеина, 1 мкМ [y-32p]ATP с удельной активностью 0,2 МБк/ммоль и 0,01—0,2 мг/мл АТ согласно [12]. Смесь инкубировали при 37 °С в течение 1,5 ч. Фосфо-рилирование казеина анализировали с помощью SDS-электрофореза в 12%-ном ПААГ с последующим радиоавтографированием гелей. Радиоавтографы анализировали с помощью программы Image Quant.
Реактивы и материалы
В работе использовали реактивы фирм «Sigma» (США) и «Pharmacia» (Швеция). Устойчивая к ДНКазам (сшивая глутаровым альдегидом) ДНК-целлюлоза производства «НИКТИ БАВ» (Россия), пластины Kieselgel 60 — «Merck» (Германия). Растворители и соли были квалификации ос.ч., Россия.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как было показано ранее, IgG и sIgA антитела из молока здоровых рожениц с присутствии АТР фосфорилируют казеин [12]. Фосфорилирование казеина анализировали по относительному включению в него [32P]
метки с последующим радиоавтографирова-нием гелей согласно [12]. Кроме того, в1дА и 1дС прочно связаны с минорными липидами [16]. Инкубация 1дС и в1дА с у-[32Р]АТР приводит к фосфорилированию этих липидов. Разрушение прочных комплексов АТ с липи-дами происходит только после добавления в водные растворы АТ органических растворителей (15 % диоксана или 30 — 40 % этилового спирта) или при экстракции липидов смесью метанол-хлороформ [16]. Анализ относительного уровня фосфорилирования липи-дов, экстрагированных смесью хлороформ-метанол, проводили с помощью ТСХ, как описано ранее [16]. Кроме того, 1дС и в1дА молока рожениц обладают ДНКазной активностью, которая легко тестируется по уменьшению суперскрученной ДНК при перехо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.