научная статья по теме КАТАЛИТИЧЕСКИЕ И СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ИММОБИЛИЗОВАННОЙ АМИДАЗЫ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS 4-1 Химия

Текст научной статьи на тему «КАТАЛИТИЧЕСКИЕ И СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ИММОБИЛИЗОВАННОЙ АМИДАЗЫ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS 4-1»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 5, с. 482-489

УДК 577.151.6

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ И СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ИММОБИЛИЗОВАННОЙ АМИДАЗЫ Rhodococcus rhodochrous 4-1

© 2015 г. А. Н. Горбунова*, Ю. Г. Максимова*, **, Г. В. Овечкина*, А. Ю. Максимов*, **

*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 614081

e-mail: maks@iegm.ru

**Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, 614990

Поступила в редакцию 04.02.2015 г.

Амидазу Rhodococcus rhodochrous 4-1 иммобилизовали, используя ковалентное присоединение к активированному хитозану, физическую сорбцию на углеродсодержащих адсорбентах и образование поперечно-сшитых агрегатов фермента в отсутствие носителя. Проведен сравнительный анализ некоторых каталитических свойств свободной и иммобилизованной на хитозане амидазы. Показано, что фермент, ковалентно иммобилизованный на хитозане, сохранял 50—60% исходной активности и обладал более высокой термостабильностью по сравнению с растворимой амидазой, а также сохранял более 20% активности на протяжении пяти 24-часовых циклов трансформации акриламида. Изучено влияние способов иммобилизации на стереоселективные свойства амидазы в модельной реакции трансформации рацемического лактамида до D- и L-молочной кислоты. Показано, что поперечно-сшитые агрегаты амидазы обладали высокой D-стереоселективностью (до 77—94%). Максимальная энантиоселективность иммобилизованного фермента наблюдалась при 60°С.

Ключевые слова: амидаза, иммобилизованный фермент, стереоселективность, поперечно-сшитые агрегаты фермента.

DOI: 10.7868/S0555109915050074

Гетерогенные биокаталитические процессы обладают рядом существенных преимуществ перед гомогенными. Иммобилизованные ферменты легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. При иммобилизации фермента изменяются такие его свойства, как активность, субстратная специфичность и устойчивость к различным факторам окружающей среды. Иммобилизованные ферменты стабильнее свободных в течение длительных периодов времени, что обеспечивает перспективность их использования в промышленности [1].

Среди гидролитических ферментов, используемых в качестве катализаторов в химических превращениях, большой интерес вызывают амидазы (ациламидамидогидролазы, КФ 3.5.1.4), катализирующие гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония [2, 3]. Амидазы широко распространены и встречаются как у про-, так и у эукариот, при этом основным источником данных ферментов являются клетки бактерий. На основании аминокислотных последовательностей и различий в структуре амидазы подразделяются на две группы: суперсемейство нитрилаз и семейство сигнатурных амидаз. Ферменты суперсемейства нитрилаз образуют в растворе гомотетрамерные и гомогексамерные ком-

плексы и содержат в активном центре консервативную каталитическую триаду глутамин-цистеин-лизин. Ферменты семейства сигнатурных амидаз формируют гомодимерные и гомооктамерные комплексы и отличаются наличием высоко консервативной последовательности, состоящей из приблизительно 130 аминокислотных остатков. Каталитическая триада их активного центра включает остаток лизина и два остатка серина [4, 5]. Такие амидазы обладают широкой субстратной специфичностью, они способны, наряду с алифатическими амидами, гидролизовать ароматические и разветвленные амиды (фенилацетамид, 2-фенил-пропионамид и амид миндальной кислоты). Большинство сигнатурных амидаз проявляют стереоселективность [6].

Биокатализаторы, включающие клетки бактерий и обладающие высокой амидазной активностью, могут быть использованы при получении различных карбоновых кислот (в том числе, аммонийных солей акриловой и никотиновой кислот) и нестероидных противовоспалительных препаратов [6—8], изолированные стереоселективные амидазы — при синтезе ряда коммерчески значимых продуктов в оптически чистой форме, например, стереоизомеров аминокислот и их производных [9-12].

Основные ограничения применения этих ферментов связаны с нестабильностью их структуры и чувствительностью к отклонениям от узкого диапазона оптимальных условий [13]. Иммобилизация приводит к повышению стабильности фермента и, следовательно, к многократному увеличению количества продукта реакции.

Сведения об иммобилизации изолированных амидаз немногочисленны. Иммобилизацию этих ферментов осуществляли путем включения в гели полимеров синтетического и природного происхождения [14], адсорбции на активированном Амберлите-ХЛЭ57 [14], ковалентного присоединения к носителю [15, 16] и образования поперечно-сшитых агрегатов фермента [17]. Так, термостабильная амидаза Geobacillus pallidus RAPc8, иммобилизованная в гранулы полиакри-латного полимера Эупергита (Eupergit®^ "Degussa Röhm Gmbh&Co", Германия), катализировала D-селективный гидролиз лактамида. При этом наблюдалась высокая степень связывания фермента с гранулами Эупергита и практически сохранялось 80% исходной амидазной активности [14]. Пенициллин-амидаза, ковал ентно иммобилизованная в Эупергите, активированном эпоксидными группами, была использована в промышленном масштабе [15]. Нативная и конъюги-рованная с декстраном пенициллин-амидаза была ковалентно присоединена к диоксиду кремния с активированными аминогруппами, что приводило к увеличению ее термостабильности [16]. Поперечно-сшитые коагрегаты амидазы Rhodococcus erythropolis и БСА, образованные поперечным сшиванием глутаровым альдегидом, после осаждения сульфатом аммония оставались стабильными как при повышении температуры до 50° С, так и в диапазоне рН от 5 до 12 [17]. Показано, что амидаза R. erythropolis, коиммобилизованная с нитрилазой Aspergillus niger на бутил-сефарозе, гидролизовала 4-цианопиридин в изоникотино-вую кислоту [18]. Хотя одним из наиболее важных для биокатализа свойств амидаз является их сте-реоселективность, практически отсутствуют данные о влиянии различных способов иммобилизации этих ферментов на стереоизомерию образующихся продуктов.

Цель работы — получение иммобилизованной амидазы Rhodococcus rhodochrous методами ковалентного присоединения к активированному хи-тозану, адсорбции на углеродсодержащих носителях и поперечного сшивания в агрегаты, а также изучение влияния методов иммобилизации на ее каталитические и стереоселективные свойства.

МЕТОДИКА

В работе использовали штамм Rhodococcus rhodochrous 4-1, обладающий амидазной активностью, который был выделен из почвы и селекцио-

нирован в Институте экологии и генетики микроорганизмов (ИЭГМ УрО РАН).

Бактерии выращивали в колбах емкостью 1 л на шейкере со скоростью вращения 150 об./мин при 30°С до стационарной фазы роста на минимальной солевой среде следующего состава (г/л): КН2Р04 - 1.0, К2НР04 • 3H2O - 3.7, NaCl - 0.5, MgSO4 • 7H2O - 0.5, FeSO4 • 7H2O - 0.005, СоС12 • • 6H2O - 0.01, рН 7.2-7.4. В качестве источника углерода использовали глюкозу (0.1%), источника азота - ацетонитрил (10 мМ). Биомассу отделяли центрифугированием 20 мин при 10000 g, клетки отмывали от среды и ресуспендировали в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7.4, содержащим 0.044 М бутират натрия. Клетки разрушали десятикратной обработкой ультразвуком (УЗГ8 0.4/22, "ВНИИ ТВЧ", Россия) по 15 с при частоте 22 кГц при 0-4°С. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 10000 g и 4°С, затем фракционировали белок сульфатом аммония, последовательно доводя концентрацию до 35 и 60% насыщения. Количество белка в пробе определяли с Кумасси бриллиантовым синим G-250 по методу Бредфорд. В качестве стандарта использовали БСА [19].

Ковалентное присоединение амидазы к активированному хитозану проводили следующим образом. Для получения гранул 2%-ный (вес/об.) раствор хитозана средней вязкости ("Sigma", Япония) в 2%-ной (об./об.) уксусной кислоте накапывали с помощью шприца объемом 5 мл в 1 М раствор КОН. После затвердевания в течение 1 ч гранулы отмывали однократно 0.01 М калий-фосфатным буфером, рН 7.2 ± 0.2. Полученные гранулы активировали 0.1%-ным раствором бен-зохинона ("Fluka", Швейцария) в течение 15 мин в соотношении 1 : 1. Гранулы отмывали 3 раза тем же буфером, двукратно превышающим объем раствора бензохинона. Активированные гранулы хитозана смешивали с ферментом в соотношении 2.5 : 1 и инкубировали в течение 40 мин при 22-25°С, затем отмывали 3 раза фосфатным буфером, пятикратно превышающим объем раствора белка. Содержание белка, связавшегося с активированным хитозаном, определяли по разности его концентрации в растворе до и после контакта с носителем. Полученный иммобилизованный фермент хранили при температуре от 0 до +10°С.

Амидазу адсорбировали на углеродсодержащих носителях: мезопористом Сибуните, Sw = = 441 м2/г (Институт катализа им. Г. К. Борескова СО РАН, Россия) и сферическом углерод-минеральном сорбенте (СУМС), Sw = 220 м2/г (Россия) [20]. Раствор белка (2 мл) инкубировали с 50 мг носителя в течение 2 ч при 22-25°С на шейкере со скоростью вращения 100 об./мин, носитель отмывали 0.01 М калий-фосфатным буфером, рН 7.2 ± ± 0.2, до исчезновения белка в промывных водах. Количество адсорбированного белка определяли

Таблица 1. Стадии очистки ферментного препарата, содержащего амидазу

Стадия очистки Общая активность, мкмоль/мин Концентрация белка, мг/мл Удельная активность, мкмоль/мг мин Степень очистки

Супернатант 6.02 ± 1.95 11.5 ± 3.88 0.59 ± 0.22 1

Осаждение сульфатом аммония 35% от насыщения 3.72 ± 0.77 1.84 ± 0.97 2.69 ± 1.23 4.6

То же 60% от насыщения 3.49 ± 1.08 0.77 ± 0.28 4.90 ±2 .06 8.3

по разности его концентрации в растворе до и после контакта с носителем.

Для получения поперечно-сшитых агрегатов фермента (ПСАФ) проводили обработку 0.1%-ным раствором глутарового альдегида или 0.1%-ным раствором бензохинона одновременно с фракционированием сульфатом аммония белка, выделенного при разрушении клеток Я. гкойоскгош 4-1.

Трансформацию раствора акриламида (от 0.01 до 0.8 М) в 1-5 мл калий-фосфатного буфера, рН 7.2 ± 0.2, проводили в течение 60 мин при 25°С. Реакцию останавливали добавлением концентрированной НС1 до конечной концентрации 5%. Концентрацию об

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком