ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 5, с. 484-489
УДК 577.152.35
КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НИТРИЛГИДРАТАЗЫ, ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА АКТИВИРОВАННОМ ХИТОЗАНЕ
© 2012 г. Ю. Г. Максимова*, Т. А. Рогожникова**, Г. В. Овечкина*, А. Ю. Максимов*, В. А. Демаков*
*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 614081
e-mail: maks@iegm.ru **Пермский государственный университет, Пермь, 614990 Поступила в редакцию 29.06.2011 г.
Исследованы каталитические свойства нитрилгидратазы, изолированной из штамма Rhodococcus ruber gtl и иммобилизованной методом ковалентнои сшивки с хитозаном, активированным 0.1%-ным раствором бензохинона. Определены кинетические параметры реакции гидратации акрило-нитрила, катализируемой иммобилизованной нитрилгидратазой и ферментом в растворе. Установлено, что иммобилизация не приводит к снижению максимальной скорости реакции (Кмакс), тогда как константа Михаэлиса (Км) уменьшается в 2.4 раза. Показана возможность многократного использования иммобилизованного фермента на протяжении 50 последовательных циклов трансформации акрилонитрила, причем активность нитрилгидратазы в 50 цикле превышала таковую в первом цикле в 3.5 раза. Показано, что влияние температуры на активность зависело от концентрации фермента, что подтверждает диссоциативный характер инактивации нитрилгидратазы. Обнаружено, что иммобилизованная нитрилгидратаза сохраняет активность при рН 3.0—4.0, тогда как фермент в растворе в этих условиях инактивируется. Полученный биокатализатор может эффективно использоваться для получения акриламида из акрилонитрила.
Нитрилгидратаза (КФ 4.2.1.84), катализирующая гидратацию нитрилов до амидов, является ключевым ферментом метаболизма нитрилов у микроорганизмов. Этот фермент применяется в крупномасштабном промышленном производстве из соответствующих нитрилов акриламида и никотинамида, используемых в химической и фармацевтической индустрии [1, 2]. Биотехнологическое производство акриламида в России основано на высокопродуктивном штамме родо-кокков — ЯНоёососсш гНойосНгот М8 [3—5], в Японии — Я. гНойосНгот Л. У промышленно значимого штамма Я. гНойосНгош Л обнаружено два вида нитрилгидратаз — высокомолекулярная (520 кДа) и низко молекулярная (130 кДа), гены которых экспрессируются в зависимости от индуктора, добавленного в среду культивирования. Оба фермента — гетеромеры, состоящие из а- и р-субъ-единиц: высокомолекулярный фермент содержит по 8—10, низкомолекулярный — по 2 каждой субъединицы [6]. Нитрилгидратаза штамма Я. гНо^сН-гот М8, как и Я. гНойосНгот Л, является гетеро-мером и содержит ионы кобальта в активном центре [4].
Стабилизация ферментов является необходимым этапом на пути их широкого внедрения в производство. Ограничение конформационных перестроек белковой глобулы позволяет сохранить работоспособность активного центра в течение длительного времени [7]. Иммобилизация на
нерастворимом носителе, основанная на физико-химических принципах, дает возможность более длительной эксплуатации ферментов и, как следствие, повышения их продуктивности.
Перспективным носителем для иммобилизации ферментов является хитозан, получаемый при деацетилировании хитина. По химической структуре хитозан — сополимер Э-глюкозамина и М-ацетил-Э-глюкозамина. В высокомолекулярных линейных цепях полиглюкозамина имеется большое количество реакциоспособных амино- и гидроксильных групп, подверженных химическим модификациям [8]. За счет образования большого количества водородных связей он может функционировать как универсальный сорбент, связывающий различные вещества органической и неорганической природы [9]. Большое количество реакционноспособных групп в молекуле определяет его способность взаимодействовать с бифункциональными реагентами, образующими химические связи как с молекулой хитозана, так и с молекулой белка, что делает возможным ковалентную сшивку фермента с хитозаном. При ковалентном присоединении ферментов к носителю в качестве бифункционального реагента часто используют глутаровый альдегид [10]. В случае иммобилизации нитрилгидратазы этот активатор не является предпочтительным, т.к. ингибирует ее активность [11]. Сведений об активировании но-
сителей бензохиноном для ковалентной сшивки ферментов практически не встречается.
Нами ранее было изучено влияние адсорбционной иммобилизации на неорганических носителях, включая немодифицированные и углеродсо-держащие оксиды алюминия, а также углеродный носитель Сибунит, на активность и стабильность нитрилгидратазы [12]. Активность полученного иммобилизованного фермента не превышала 610% исходной в растворе, что обусловило необходимость дальнейших поисков предпочтительных методов иммобилизации нитрилгидратазы.
Цель работы — получение биокатализатора трансформации акрилонитрила в акриламид на основе ферментного препарата, содержащего нит-рилгидратазу, ковалентно иммобилизованного на активированном хитозане, и изучение его каталитических свойств.
МЕТОДИКА
Нитрилгидратазу выделяли из штамма бактерий R. ruber gt l, обладающего высокой нитрилгид-ратазной активностью [13]. Бактериальную культуру выращивали в колбах объемом 1 л на качалке со скоростью вращения 100 об/мин при 30°С до стационарной фазы роста на минимальной солевой среде следующего состава (г/л): КН2Р04 — 1.0, К2НР04 • 3H2O - 3.7, NaCl - 0.5, MgSO4 • 7H2O -0.5, FeSO4 • 7H2O - 0.005, СоС12 • 6H2O - 0.01, рН 7.2-7.4. В качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 0.1%, источник азота - хлористый аммоний в концентрации 10 мМ. Биомассу центрифугировали 20 мин при 10 500 g, отмывали клетки от среды и ресуспенди-ровали в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7.4, содержащем 44 мМ бутират натрия. Клетки разрушали десятикратной обработкой ультразвуком (УЗГ8-0.4/22, ВНИИ ТВЧ г. Санкт-Петербург, Россия) по 15 с при частоте 22 кГц с охлаждением до 0-4°С. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 10500 g и температуре 4°С, затем проводили фракционирование белка сульфатом аммония, последовательно доводя концентрацию до 35 и 60% от насыщающей. В препарате, полученном при 60%-ном насыщении сульфата аммония, содержание фермента составило 72% от общего количества белка. Количество белка в пробе определяли по методу Бредфорд с красителем Кумасси бриллиантовым синим G-250. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин [14].
Нитрилгидратазу иммобилизовали методом ковалентной сшивки с активированным хитоза-ном. Готовили 2%-ный (вес/об.) раствор хитозана средней вязкости ("Sigma", Япония) в 2%-ной (об./об.) уксусной кислоте и накапывали с помощью шприца для инъекций объемом 5 мл в 1 М
раствор КОН. После затвердевания в течение 1 ч гранулы отмывали однократно 0.01 М калий-фосфатным буфером, рН 7.2 ± 0.2. Полученные гранулы активировали 0.1%-ным раствором бен-зохинона ("Fluka", Швейцария) в течение 15 мин в соотношении гранул и активатора 1 : 1. Отмывали 3 раза фосфатным буфером, двукратно превышающим объем раствора бензохинона. Активированные гранулы смешивали с ферментным препаратом в соотношении 2.5 : 1, после 40 мин инкубации при 22—25°С отмывали 3 раза фосфатным буфером, пятикратно превышающим объем раствора белка. Количество белка, связанного с активированным хитозаном, определяли по разности концентрации белка в растворе до и после контакта с носителем. Полученный иммобилизованный препарат хранили при температуре от 0 до + 10°С.
Нитрилгидратазную активность растворенного и иммобилизованного фермента определяли по концентрации акриламида, образующегося за 10 мин трансформации раствора акрилонитрила (НАК). Удельную активность нитрилгидратазы (Е) выражали в мкмоль амида/мг белка мин.
Концентрацию акриламида определяли методом ВЭЖХ на хроматографе LC-10 ("Shimadzu", Япония) с колонкой Synergi 4u Hydro-RP 80А (250 х 4.6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 25 мМ №Н2Р04, скорость потока составляла 0.75 мл/мин при 25°С, детекцию проводили при длине волны 200 нм.
Константу Михаэлиса (Км) и максимальную скорость (Кмакс) нитрилгидратазной реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом и ферментом в растворе, вычисляли по графику Лайнуивера—Берка, построенному по методу двойных обратных величин. Для этого проводили реакции трансформации растворов НАК в диапазоне концентраций от 0.015 до 1.36 М в 1—5 мл калий-фосфатного буфера (рН 7.2 ± 0.2) в течение 10 мин, реакцию останавливали добавлением концентрированной НС1 до конечной концентрации 5%, концентрацию образующегося акриламида определяли методом ВЭЖХ.
Операционную стабильность нитрилгидратазы, иммобилизованной на активированном хито-зане, оценивали по сохранению нитрилгидра-тазнои активности при последовательном проведении 10 мин циклов конверсии 0.58 М раствора акрилонитрила. После проведения реакционного цикла гранулы хитозана с иммобилизованным на них ферментом отмывали калий-фосфатным буфером (рН 7.2 ± 0.2) и использовали в следующем цикле.
Зависимость активности иммобилизованной нитрилгидратазы и фермента в растворе от температуры определяли при проведении десятиминутной трансформации 0.58 М раствора акрило-
486 МАКСИМОВА и др.
Каталитические свойства свободной и иммобилизованной нитрилгидратазы
Нитрилгидратаза КМ, моль/л V г макс Кин, мин 1
мкмоль/мг мин 40°С 50 °С 60 °С
В растворе 0.41 ± 0.15 50 6.6 х 10—3 2.7 х 10-2 1.4 х 10-1
Иммобилизованная 0.17 ± 0.05 50 2.2 х 10—3 2.4 х 10-2 1.0 х 10-1
нитрила при температуре от 10 до 70°С в калий-фосфатном буфере (рН 7.2 ± 0.2) с предварительным нагревом реакционной смеси до внесения субстрата в течение 10 мин. Нагрев и трансформацию субстрата осуществляли в термостате ТС — 1/80 СПУ ("Лабтех", Россия). Реакцию останавливали, как описано выше. Концентрацию акрил-амида определяли методом ВЭЖХ.
Термостабильность фермента определяли следующим образом: иммобилизованную и натив-ную нитрилгидратазу в калий-фосфатном буфере (рН 7.2 ± 0.2) прогревали при 40, 50 и 60°С в течение 15, 30, 45 и 60 мин, резко охлаждали на ледяной бане и проводили реакцию трансформации 0.58 М раствора акрилонитрила при 22°С. Определяли нитрилгидратазную активность, как описано выше. Конст
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.