ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 4, с. 416-421
УДК 577.152.35:579.66
КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НИТРИЛГИДРАТАЗЫ, ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА ОКСИДАХ АЛЮМИНИЯ И УГЛЕРОДСОДЕРЖАЩИХ АДСОРБЕНТАХ
© 2010 г. Ю. Г. Максимова*, В. А. Демаков*, А. Ю. Максимов*, Г. В. Овечкина*, Г. А. Коваленко**
*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 614081
e-mail: maks@iegm.ru **Институт катализа СО РАН, Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 12.01.2009 г.
Нитрилгидратаза, выделенная из штамма Rhodococcus rubergtl, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, иммобилизована на немодифицированных оксидах алюминия и углеродсодержащих адсорбентах, в том числе на углеродном носителе Сибуните. Изучена активность и операционная стабильность адсорбированной нитрилгидратазы в реакции трансформации акрилонитрила в акриламид. Показано, что повышение содержания углерода в составе носителя приводило к возрастанию количества адсорбированного фермента и, в то же время, к снижению его активности. Наибольшей операционной стабильностью в процессе гидратации акрилонитрила обладала нитрилгидратаза, иммобилизованная на Сибуните и углеродсодержащем а-оксиде алюминия, имеющем коровое строение. Обнаружено, что при адсорбции термостабильность нитрилгидратазы повышалась на порядок.
Нитрилгидратазы (КФ 4.2.1.84) катализируют гидратацию нитрильных соединений в соответствующие амиды и используются в промышленном производстве важных в народном хозяйстве химических веществ, в частности акриламида [1]. В качестве биокатализаторов трансформации акрилонитрила в акриламид могут использоваться как целые клетки нитрилконвертирующих бактерий, обладающие высокой нитрилгидратазной активностью, так и индивидуальный фермент, выделенный из этих клеток. В настоящее время биотехнологическое производство акриламида основано, главным образом, на использовании высокопродуктивных штаммов Ккойососи гкойоскгош Л (Япония) и К гкойоскгош М8, М33 (Россия) [2, 3]. Процесс осуществляется в гомогенных условиях с участием суспендированной клеточной биомассы. Перспективным направлением в биокатализе является применение гетерогенных биокатализаторов, приготовленных иммобилизацией целых нерастущих клеток микроорганизмов. Клетки родококков, утилизирующие нитрилы, были иммобилизованы в полиакриламидном геле и успешно использовались для конверсии акрилонитрила [4]. Ряд исследований посвящен иммобилизации клеток бактерий, активных в реакции гидролиза нитрилов, путем включения в структуру гидрогелей альгината кальция и бария [5, 6], пектина, к-карра-гинана [7], поливинилового спирта [8], агара и ага-розы [9], а также адсорбции на углеродсодержащих носителях [10].
Несмотря на значительное количество работ, посвященных очистке и характеристике нитрилгидра-
таз, большинство исследований посвящено иммобилизации целых клеток при ферментативном гидролизе нитрилов. Тем не менее, очищенные ферменты могут оказаться более предпочтительными для производства амидов, не загрязненных карбоновыми кислотами, которые образуются в результате последующих превращений амидов с участием фермента амидазы (КФ 3.5.1.4) [11]. Очевидно, что использование иммобилизованных (а не растворимых) ферментов в качестве регенерируемых, устойчивых и специфических промышленных катализаторов перспективно [12].
О методах, подходящих для иммобилизации очищенных нитрилгидратаз, известно немного. Нитрилгидратазу из Rhodococcus equi иммобилизовали на ДЭАЭ-целлюлозе и носителе Eupergit® С ("Degussa, Röhm Gmbh.", Германия), но стабильность полученных препаратов была низкой [11]. Принимая во внимание, что внутриклеточные ферменты функционируют не в разбавленном растворе, а в сложной гетерогенной среде, иммобилизация нитрилгидратазы с целью создания активного и стабильного биокатализатора представляет как практический, так и теоретический интерес.
Цель работы — изучение влияния адсорбционной иммобилизации нитрилгидратазы на неорганических носителях, включая немодифицированные и углеродсодержащие оксиды алюминия, а также углеродный носитель Сибунит, на активность и стабильность фермента в реакции трансформации акрилонитрила в акриламид.
МЕТОДИКА
Нитрилгидратаза была выделена из полученного в результате селекции штамма бактерии R. ruber gt1, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью [13, 14]. Бактериальную культуру выращивали до стационарной фазы на минимальной солевой среде с глюкозой (0.1%) в качестве источника углерода, центрифугировали 20 мин при 10500 g, отмывали клетки от среды и ресуспендировали в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7.4, содержащем 44 мМ бутират натрия. Клетки разрушали шестикратной обработкой ультразвуком по 30 с при частоте 22 кГц и 0—4°С. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 10500 g и температуре 4°С, затем проводили фракционирование белка сульфатом аммония, последовательно доводя концентрацию до 35 и 60% от насыщающей. В препарате, полученном при 60%-ном насыщении сульфата аммония, содержание фермента составило 72% от общего количества белка. Количество белка в пробе определяли по методу Брэдфорд с красителем Кумасси бриллиантовым синим G-250 [15].
Нитрилгидратазную активность определяли спектрофотометрически (D260) по изменению концентрации амида в реакционной среде за 1 мин трансформации. За единицу активности нитрил-гидратазы принимали такое количество фермента, которое образует 1 мкмоль амида/мг белка • мин.
Для адсорбционной иммобилизации нитрил-гидратазы использовали немодифицированные коммерческие оксиды алюминия (ОАО "Катализатор", Новосибирск, Россия): КН-21 (S^ = 0.5 м2/г, Al2O3-I) в виде колец высотой 5—6 мм, с внешним и внутренним диаметром 7 мм и 2 мм соответственно; АОК-63-31 (Яуц = 13 м2/г, Al2O3-II) в виде черенков диаметром 12 и длиной 12 мм; АОК-63-11 "С" (Яуц = 246 м2/г, Al2O3-III) в виде гранул (шарики) диаметром 0.63—1.25 мм.
Для получения углеродсодержащих адсорбентов (C/Al2O3) проводили синтез углеродного слоя, в том числе слоя каталитического волокнистого углерода (КВУ-слой), путем пиролиза водород-пропан—бутана на немодифицированных оксидах алюминия при 600°С в реакторе с неподвижным слоем катализатора в условиях, описанных в работах [16, 17].
В качестве углеродного носителя для иммобилизации нитрилгидратазы использовали мезопори-стый Сибунит с размером гранул от 0.2 до 3 мм [18]. Удельная поверхность этого носителя, измеренная по термодесорбции аргона, составила 441 м2/г, преобладающий диаметр пор — 18 нм.
Адсорбцию нитрилгидратазы проводили в растворе белка с носителем в течение 24—168 ч. Сорб-ционную емкость носителей оценивали по разности концентрации белка в растворе до и после сорбции и выражали в мг белка/г носителя.
Трансформацию 0.58 М раствора акрилонитрила с использованием иммобилизованной нитрилгид-
ратазы проводили в 5 мл 0.01 М калий-фосфатного буфера, pH 7.5, при постоянном перемешивании. Аликвоты реакционной среды отбирали через определенные промежутки времени, реакцию останавливали добавлением 2%-ной HCl. Пробы центрифугировали 5 мин при 15700 g и определяли концентрацию акриламида и акрилонитрила методом ВЭЖХ на хроматографе LC-10 ("Shimadzu", Япония) с диодно-матричным УФ- и флуоресцентным детектором и колонкой HYDRO-RP (125 х х 4.6 мм), заполненной силикагелем (фракция 4 мкм). В качестве подвижной фазы использовали раствор 25 мМ NaH2PO4 и 5% ацетонитрила, скорость потока составляла 0.5 мл/мин при температуре 25°С.
Операционную стабильность иммобилизованной нитрилгидратазы оценивали по сохранению нитрилгидратазной активности при последовательном проведении в течение 20 мин конверсии акри-лонитрила, вносимого в каждом цикле до концентрации 0.58 М. После проведения реакционного цикла биокатализаторы отмывали 0.01 М калий-фосфатным буфером, рН 7.5.
Термостабильность иммобилизованной нитрил-гидратазы определяли при проведении реакции трансформации акрилонитрила при температурах от 20 до 70°С в термостате CH-100 ("Biosan", Латвия). Через 20 мин реакцию останавливали добавлением соляной кислоты, как описано выше.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Адсорбция нитрилгидратазы. Установлено, что величина адсорбции белка на углеродсодержащих носителях выше, чем на немодифицированных оксидах алюминия (табл. 1). Очевидно, что присутствие углерода в составе адсорбента увеличивало его способность связывать фермент. Максимальная величина адсорбции составляло 8—9 мг/г (табл. 1).
При иммобилизации нитрилгидратазы на немо-дифицированных оксидах алюминия (без углерода) стационарное состояние в системе "раствор/адсорбент" устанавливалось через 10 сут. При адсорбции фермента на углеродсодержащих носителях количество адсорбированного белка постепенно возрастало (табл. 2) при увеличении продолжительности адсорбции. Это может быть обусловлено медленной диффузией фермента внутрь гранул носителя и (или) с полислойной адсорбцией молекул белка за счет межмолекулярных взаимодействий.
Трансформация акрилонитрила иммобилизованной нитрилгидратазой. При иммобилизации на углеродсодержащих адсорбентах C/Al2O3-I, II, III нит-рилгидратаза сохраняла не более 2% от первоначальной активности фермента в растворе, равной 300 мкмоль/мг • мин, тогда как на носителях без углерода фермент сохранял 6—10% исходной активности. Это может быть объяснено либо менее плот-
418 МАКСИМОВА и др.
Таблица 1. Адсорбционные свойства носителей*
Адсорбент
Sw м2/г
Япор, нм
Масса носителя, г
Адсорбированный белок, мг/г
Al2O3-I
Al2O3-II
Al2O3-III
C/a-Al2O3-I C/a-Al2O3-II C/Y-Al2O3-III C/Y-Al2O3 (марки СУМС)
Сибунит
Немодифицированные оксиды алюминия
1 13 221
2900 95 12
Углеродсодержащие оксиды алюминия 9 330
15 94
206 12 220 11
Углеродные носители 441 I 18
0.6 2.0 0.5
0.6 2.0 0.5 0.2
0.2
2.6 (4.3) 1.0 (0.5) 0.5 (1.0)
5.5 (9.2) 1 (0.5) 3 (6.0)
0.8 (4.0)
1.6 (8.0)
* Время адсорбции — 48 ч; концентрация исходного раствора белка — 14 мг/мл (для носителей Сибунит и марки СУМС 3.3 мг/мл).
Таблица 2. Кинетика адсорбции нитрилгидратазы на углеродсодержащих носителях и оксидах алюминия*
Адсорбент Содержание Величина адсорбции, мг белка/г носителя
углерода, % 24 ч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.