ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 6, с. 657-663
УДК 57.083.1
КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОДЕГРАДАЦИИ АЛИФАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ БАКТЕРИЯМИ Rhodococcus ruber
И Rhodococcus erythropolis
© 2007 г. Д. В. Жуков, В. П. Мурыгина, С. В. Калюжный
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, 119992
e-mail: dimok_zh@mail.ru Поступила в редакцию 27.04.2006 г.
Исследовали потребление алифатических углеводородов бактериями Rhodococcus ruber Ас-1513-D и Rhodococcus erythropolis Ас-1514-D при росте на смеси жидких н-алканов и дизельном топливе. Обнаружили снижение активности штаммов по отношению к углеводородам дизельного топлива по сравнению с углеводородами использованной смеси жидких парафинов. Выявлены различия в росте штаммов и потреблении ими субстратов, в связи с чем можно предположить, что эти два штамма используют различные механизмы захвата углеводородов.
Проблема очистки различных природных объектов от загрязнения сырой нефтью и продуктами ее переработки по-прежнему остается актуальной. В связи с этим все более широкое распространение получают биотехнологические методы, основанные на способности некоторых микроорганизмов использовать углеводороды и другие компоненты нефти в качестве единственного источника углерода и энергии.
В настоящее время большое внимание уделяется изучению взаимодействия нефтедеградиру-ющих культур в консорциумах, на базе которых могут быть созданы препараты, позволяющие более эффективно и глубоко утилизировать нефть. Как правило, действие консорциума микроорганизмов более эффективно по сравнению с действием монокультур [1-3]. Предложено два основных подхода создания биопрепаратов на основе микроорганизмов, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки. Первый основан на создании консорциума микроорганизмов, полученного посредством комбинирования ряда штаммов с известной деградирующей способностью (определенный консорциум). Этот способ является строго определенным и повторяемым, но для того, чтобы увеличить степень биодеградации углеводородов и расширить число утилизируемых соединений, необходим консорциум из большого числа штаммов-деструкторов. Второй подход, включающий получение так называемых неопределенных консорциумов - консорциумов с неизвестными характеристиками каждого из его членов, может быть особенно эффективен для деградации определенного загрязнителя, к которому данный консорциум заранее адаптирован [4]. Однако, стоит учитывать, что при использовании консорциумов, подобранных любым из
этих способов, могут происходить различные коме-таболические процессы, в том числе накопление трудноразлагаемых токсичных веществ, которые могут подавить дальнейшее развитие популяции микроорганизмов [5, 6].
Известно, что одной из наиболее высоких неф-тедеградирующих активностей среди микроорганизмов обладают различные виды бактерий, относящиеся к роду Rhodococcus [7, 8]. На основе этих видов бактерий, часто в сочетании с микроорганизмами, относящимися к другим родам (Acinetobacter, Actinomyces, Arthrobacter, Thiobacte-rium, Pseudomonas, Bacillus), в том числе к микроскопическим грибам, например Candida sp. [9-11], разработаны биопрепараты, которые успешно используются для очистки почв и водных поверхностей от нефтяных загрязнений. Одним из таких биопрепаратов является препарат Родер, созданный на основе высокоактивных деградирующих нефть штаммов бактерий R. erythropolis Ас-1514-D и R. ruber Ас-1513-D [12]. Однако ранее не проводилось углубленного изучения кинетических закономерностей воздействия на компоненты углеводородных субстратов каждого штамма отдельно и вместе, что было бы интересно, поскольку это -определенный консорциум, и он с успехом применялся и продолжает применяться для очистки водной поверхности и почвы от углеводородов нефти и для деконтаминации нефтешламов [13-15].
Цель работы - выявление сходств и различий жизнедеятельности бактерий R. ruber Ас-1513-D и R. erythropolis Ас-1514-D при потреблении ими алифатических углеводородов путем изучения кинетики роста исследуемых штаммов на минеральной среде Раймонда со смесью жидких парафинов в качестве единственного источника углерода, а также на минеральной среде Раймонда с дизель-
ным топливом в качестве единственного источника углерода.
МЕТОДИКА
Объекты исследования. R. ruber Ас-1513-D и R. erythropolis Ас-1514-D, выделенные в виде чистых культур в 1991-1992 гг. в лаборатории микробиологии ВНИИ нефти им. А.П. Крылова (Москва), перед проведением экспериментов были адаптированы к изучаемым субстратам путем нескольких пересевов.
Условия культивирования. В качестве субстрата использовалась смесь нормальных жидких парафинов в концентрации 0.5 об.%, содержащая (%): СВН28 - 7.5; С14Нэ<> - 24.0; С^ - 30.6; С16Н34 - 24.2; С17Н36 - 11.2; примеси - 2.5; и дизельное топливо в концентрациии 0.5 об.%.
Минеральную среду, содержащую (г/л): CaCl2 • • 6H2O - 0.01; MnSO4 • 7H2O - 0.02; Na2HPO4 - 1.5; KH2PO4 - 1.0; MgSO4 - 0.2; NH4Cl - 2.0; NaCl - 5.0 (рН 7.0), стерилизовали при 120°С в течение 30 мин. Культивирование проводили в аэробных условиях (50% кислорода в газовой фазе) при 27°С в стеклянных флаконах объемом 120 мл, содержащих 40 мл минеральной среды, герметично закрытых резиновыми пробками.
Содержание СО2. Анализы проводили на хроматографе ЛХМ 8 МД-модель 3 (Россия) с ката-рометром, газ-носитель - аргон, скорость газа-носителя - 20 мл/мин. Носитель - порапак QS. Для каждого анализа отбирали пробу газовой фазы 0.2 мл.
Содержание углеводородов. Определения проводили на газовом хроматографе Shimadzu GC-15A (Япония). Расчет содержания компонентов осуществляли по отношению площадей пиков с применением внутреннего стандарта - н-ун-декана ("РЕАХИМ", Россия).
Использовали капиллярную колонку Ultra 1 (50м х 0.2мм х 0.5мкм), неподвижная фаза - ме-тилсиликоновая, инжектор с делением потока, детектор - пламенно ионизационный, температура инжектора и детектора 300°С, газ-носитель -гелий; скорость газа-носителя в колонке 2мл/мин, начальная температура колонки 120°С, скорость нагрева 10°С/мин, конечная температура 230°С.
Экстракцию жидких парафинов проводили тремя объемами гексана (10 + 5 + 5 мл). После испарения гексана к жидким парафинам добавляли ундекан (40 мкл) и проводили хроматографиче-ский анализ.
Содержание белка. Прирост биомассы микроорганизмов оценивали по общему содержанию белка в среде методом Бредфорд. Для этого отбирали пробу жидкой фазы объемом 0.5 мл, добавляли 0.5 мл 3 М NaOH, кипятили 1 ч, центрифугирова-
ли после охлаждения (5 мин, при 12000 об/мин) и в супернатанте определяли содержание белка.
Расчет кинетических параметров. Скорость роста при постоянстве концентрации субстрата выражается дифференциальным уравнением первого порядка с разделяющимися переменными:
М(0 = М0вц(,
где М0 - количество биомассы в начальный момент времени.
Строя зависимость натурального логарифма содержания биомассы (внутриклеточного белка) от времени, по тангенсу угла наклона можно определить удельную скорость роста клеточной популяции (ц), характеризующую скорость роста популяции в экспоненциальной фазе.
Двухстадийная модель роста микробной популяции характеризуется гиперболической зависимостью скорости роста от концентрации субстрата и линейной зависимостью между концентрацией биомассы в замкнутой системе и количеством субстрата. Уравнение скорости роста культуры имеет вид ёМ/& = цМ или:
YsdS = -dM.
Коэффициент Ys имеет смысл стехиометриче-ского коэффициента, который в микробиологической литературе получил название экономического коэффициента. Предполагается, что во всем временном интервале развития культуры Ys постоянен. Интегрирование последнего соотношения приводит к линейной связи между концентрацией субстрата и биомассы [16]:
M-M0 = Ys(S0 - S).
Удельная активность биомассы (q), величина равная отношению удельной скорости роста к экономическому коэффициенту (отражающая катаболические процессы), характеризует протекание метаболизма бактерий. Эта величина показывает, какое количество субстрата потребляется граммом биомассы в единицу времени.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Кинетические закономерности биодеградации жидких парафинов. На рис. 1 представлены результаты изучения кинетики деградации углеводородов индивидуальными штаммами R. ruber и R. erythropolis. Видно, что через 180 ч, когда биоразложение субстрата составило 34 и 79% для R.ruber и R. erythropolis соответственно, процесс деградации углеводородов существенно замедлялся. Сведение баланса по углероду показало, что эквимолярного преобразования субстрата в
, ммоль
(а)
Белок г/л [C], ммоль
1 0.10
0.08
-0.06
(в)
10(1
6 -
0.04 4 0.02 2 00
pH 7.0i
рн
(•) CO2 (газ), ммоль 7 0
" / ##
2.0
1.5
1.0
0.5
6.5
6.0
5.5
5.0
200
300 ч
4.5 0 4.0,
Белок, г/л 0.08
(г) CO2 (газ), ммоль 1
0
А А
50 ~ 100 150
200 ч
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
8
Рис. 1. Кинетические кривые потребления субстрата и накопления биомассы (а): 1 - содержание общего белка; 2 - содержание углеводородов, пересчитанное на моль-эквиваленты углерода; изменение значения рН и накопление углекислого газа (б): 1 - накопление СО2 в газовой фазе; 2 - практически полученные значения рН; сплошная линия -значения рН, теоретически рассчитанные из данных содержания СО2 при росте R. rubber; кинетические кривые потребления субстрата и накопления биомассы (в): 1 - содержание общего белка; 2 - содержание углеводородов, пересчитанное на моль-эквиваленты углерода, изменение значения рН и накопление углекислого газа (г): 1 - накопление СО2 в газовой фазе; 2 - практически полученные значения рН; сплошная линия - значения рН, теоретически рассчитанные из данных содержания СО2 при росте R. erythropolis на смеси жидких парафинов в качестве единственного источника углерода.
углекислый газ в экспериментах не наблюдалось. Это можно объяснить тем, что в результате адсорбции субстрата на клеточных стенках, а также его накопления внутри клеток, данная фракция перестает быть доступной для экстракции. К концу экспериментов наблюдалось снижение величин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.