ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2013, том 87, № 7, с. 1231-1235
ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ ЯВЛЕНИЙ
УДК 577.150.3
КИНЕТИКА АДСОРБЦИИ ГЕМОГЛОБИНА НА КРЕМНЕЗЕМНЫХ АДСОРБЕНТАХ С БИМОДАЛЬНЫМ РАСПРЕДЕЛЕНИЕМ ПОР © 2013 г. Л. Ф. Атякшева, И. И. Иванова, Е. Е. Князева, Е. С. Чухрай
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет E-mail: Atyaksheva@phys.chem.msu.ru Поступила в редакцию 18.06.2012 г.
Проведено сравнительное изучение кинетики адсорбции гемоглобина на силохроме и синтезированных кремнеземах с бимодальным распределением пор. Установлен механизм адсорбции и показано наличие обратимой стадии. Из экспериментальных данных определены константы скорости адсорбции, десорбции и необратимого связывания. Показано влияние условий синтеза на кинетические закономерности адсорбционного процесса.
Ключевые слова: кинетика, адсорбция, гемоглобин, бипористые кремнеземы.
DOI: 10.7868/S0044453713070054
Использование адсорбции как метода иммобилизации ферментов основано на возможности необратимой адсорбции белка без существенной потери каталитической активности. Необратимо адсорбированные монослои белка не являются термодинамически равновесными, поэтому при исследовании механизмов их формирования важную роль играет кинетическое изучение процессов адсорбции. На первых этапах адсорбционного процесса энергия связи адсорбата с носителем достаточно мала, поэтому адсорбция может быть обратимой. Кинетическая схема адсорбции белков, включающая обратимую стадию, предложена в работе [1]. В дальнейшем эта схема была экспериментально подтверждена при исследовании адсорбции Р-галактозидазы [2], пероксидазы [3], гемоглобина [4], лизоцима [5]. Показано также, что скорость адсорбции различных белков зависит от размера пор адсорбента, структуры и размера белковой молекулы [6, 7].
В последние годы появились публикации по адсорбции белков на кремнеземных адсорбентах с бимодальным распределением пор [8—12]. Эти адсорбенты, как правило, на кривых распределения имеют максимумы, соответствующие порам 3—5 и 50—80 нм. Отмечается высокая скорость и значительные величины адсорбции белков [9, 11] на таких адсорбентах. Адсорбционные слои пероксидазы [10] и каталазы [12] на их поверхности проявляют высокую каталитическую активность и стабильность. В связи с этим возникла необходимость более детального исследования кинетических закономерностей адсорбции белков на поверхности кремнеземных адсорбентов с бимодаль-
ным распределением пор. В качестве тестового белка был выбран гемоглобин. Гемоглобин обладает прочной четвертичной структурой, устойчивой в широком интервале рН, не образует ассоци-атов в растворе и адсорбционных слоях, его концентрацию удобно измерять фотометрически. В адсорбированном состоянии гемоглобин образует плотные монослои, занимая молекулярную площадку, незначительно превышающую теоретическую.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Синтез кремнеземных адсорбентов с бимодальным распределением пор (бипористых кремнеземов) проводили, используя силикат натрия в качестве источника кремния, бромид цетилтри-метиламмония (ЦТАБ, Fluka) в качестве темплата и триметилбензол (ТМБ, Sigma-Aldrich) в качестве солюбилизатора. Варьировали температуру синтеза и соотношение ЦТАБ/ТМБ. Свойства синтезированных адсорбентов и силохрома промышленного производства, используемого в качестве стандарта, приведены в таблице. Характеристики пористой структуры адсорбентов определяли из изотерм низкотемпературной адсорбции азота, полученных на поромере ASAP 2010N (Mi-cromeritics). На рис. 1 приведены кривые распределения объемов пор по их диаметрам для двух синтезированных образцов.
Адсорбцию гемоглобина проводили при температуре 22°С из водных растворов при нейтральных значениях рН. Продолжительность кинетического опыта составила от 1 до 30 ч. Величину
Условия синтеза и свойства адсорбентов
Образец Т, °С ТМБ/ЦТАБ, моль/моль ^БЭТ м2/г ^ см3/г —тах^> нм а, мг/г
Силохром 120 1.0 ~45 125
1 90 0 890 2.0 3, ~55 440
2 110 0 890 1.9 3, ~80 430
3 100 0 900 2.0 3, ~70 460
4 100 0 950 1.9 3, ~75 460
5 100 1.1 900 2.2 3.5, ~60 380
6 100 3.2 880 2.1 5.5, ~75 400
7 100 4.2 810 2.2 6.5, ~50 350
Обозначения: Т — температура синтеза, а — адсорбция.
адсорбции рассчитывали по разнице концентраций гемоглобина в опытных и контрольных образцах, которую определяли спектрофотометри-чески. Начальные концентрации гемоглобина составили 1.0, 1.8, 3.5 и 6.4 мкМ. При обработке результатов кинетического эксперимента использовали подходы [1], предполагающие, что необратимому связыванию белковой молекулы с поверхностью предшествует обратимая стадия:
Е + а
кх
е а с
а
пр-
(1)
В этой схеме Е — фермент в растворе, О — контактная площадка носителя, ЕОсл и ЕОпр — слабо и прочно связанное состояние фермента на носителе, к 1, к_ь и к2 — кинетические константы скорости адсорбции, десорбции и прочного связывания соответственно. Точное решение полной схемы (1)
йУ/д\%-(Л), см3 5
3.0 18 -(Л)
Рис. 1. Кривые распределения объемов пор по их диаметрам для двух синтезированных образцов.
с учетом первой стадии обратимой адсорбции [1] имеет вид
/ _ 11п(Ьае
, . ,, П,_ (кЕо -1 к1к-1Е0Г) (1 - а). (2)
I I \ 1 — и / \ 2 /
Здесь 0 = Еадс/Ем — степень заполнения поверхности носителя ферментом; Еадс и Етах — соответственно текущее значение количества фермента в адсорбционном слое и максимальное или предельное значение, а Е и Е0 — соответственно, текущая и начальная концентрация фермента в растворе, а = Ем/(Е0У), где V — объем раствора. Более подробно порядок обработки экспериментальных кинетических данных для определения величин Еадс и Етах описан в работе [4].
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
На рис. 2 приведены зависимости предельной адсорбции гемоглобина (Ем) при разных начальных концентрациях белка от начальной концентрации (Е0) в двойных обратных координатах. Как видно на рис. 2а, в случае силохрома и бипо-ристых кремнеземов, синтезированных в присутствии триметилбензола, получены прямые, экстраполяция которых в точку 1/Е0 = 0 позволяет определить максимальную адсорбцию (Етах), соответствующую монослойному заполнению гемоглобином поверхности адсорбента. Соответствующие значения Етах приведены в таблице. Для образцов, синтезированных в отсутствие триметилбензола, зависимости, приведенные на рис. 2б можно представить как суперпозицию двух прямых, экстраполяция которых в точку 1/Е0 = 0 дает две величины предельной адсорбции. В таблице для этих образцов приведены наибольшие значения Етах.
Линейные зависимости рис. 2а свидетельствуют о структурной однородности носителя (сило-хром), либо о том, что адсорбат практически не чувствителен к неоднородности носителя (бипо-
4
3
2
1
КИНЕТИКА АДСОРБЦИИ ГЕМОГЛОБИНА
1233
1/Ем, г/г 80
60 40 20 0
(а)
10
15
20
10
0
(б)
3
20 0
10
20
1/Е0, мл/мг
Рис. 2. Зависимости предельной адсорбции гемоглобина (Ем) на различных адсорбентах от его начальной концентрации: а — силохром (1), и бипористые образцы 5 (2) и 6 (3), синтезированные в присутствии ТМБ; б — бипористые образцы 3 и 4, синтезированные в одинаковых условиях в отсутствие ТМБ.
0
5
У, 1/ч 0.4
05
10
■ 2
л3
15
20 1, ч
20
40
-0.1
-0.2 У, 1/ч
о1 ■ 2
А3
1, ч 60 т
Рис. 3. Кинетические зависимости адсорбции гемоглобина в координатах уравнения 2а: а — адсорбция на силохроме; б — адсорбция на бипористом адсорбенте 1. Начальные концентрации белка 1.0 (1), 1.8 (2) и 3.5 (3) мкМ; У = 1/11п(1 — а9)/(1 — 9).
0
0
ристые кремнеземы). Более сложные зависимо -сти рис. 2б являются результатом структурной неоднородности адсорбентов, создаваемой широким набором пор, доступных для гемоглобина. Кинетические зависимости в этом случае представляют собой суммарный эффект адсорбции гемоглобина в устьях малых пор, соизмеримых с диаметром молекулы гемоглобина (6.2 нм), и на поверхности адсорбента внутри пор большего диаметра.
Для определения кинетических констант схемы (1) опытные данные представлены графически в координатах уравнения (2) в форме уравнения (2а) (см. рис. 3).
11п (г^) = П + • (2а)
Отрезки, отсекаемые прямой на осях координат связаны с константами скорости адсорбции (^1) и десорбции белка (^-1) соотношениями (3) и (4) соответственно:
П -
кг =-°рд-, (3)
^Е0 - Етах
к-г = 2/Пабс (4)
Как видно из рис. 3а, кинетические зависимости адсорбции гемоглобина на силохроме спрямляются в координатах уравнения 2а, причем прямые пересекаются на оси абсцисс в одной точке ^абс = 17 ч. Такая зависимость исключает необратимое связывание гемоглобина на начальных стадиях адсорбции и соответствует двухстадийной схеме (1) [1]. Таким образом, при адсорбции на силохроме необратимому многоточечному связыванию гемоглобина с поверхностью предшествует значительно более быстрая стадия равновесной адсорбции белковой глобулы, образующей минимальное число водородных связей с силанольными группами поверхности кремнезема.
Кинетические зависимости адсорбции гемоглобина на бипористых кремнеземах также спрямляются в координатах уравнения (2а), но прямые не пересекаются в одной точке на оси абсцисс (см. рис. 3б). Такая зависимость может быть следствием неоднородности поверхности бипористых сорбентов и допускает протекание
хроме; б — адсорбция на бипористом адсорбенте 2. Начальные концентрации белка 1.0 (1), 1.8 (2), 3.5 (3) и 6.4 (4) мкМ.
к/ксилохрома 2-
□ кх
П к1эф
□ к_!
П к2эф
90
100
100
110 Т, °с
Рис. 5. Зависимость кинетических констант адсорбции гемоглобина от температуры синтеза бипористых кремнеземов. Синтез проводили в отсутствие триме-тилбензола.
к/кс
□ кх П к1эф □ к_!
П к2эф
0 0 1.1 3.2 4.2
сТМБ/сЦТАБ
Рис. 6. Влияние соотношения концентраций триме-тилбензола и бромида цетилтриметиламмония (ТМБ/ЦТАБ) при синтезе бипористых кремнеземов на кинетические параметры адсорбции гемоглобина. Синтез адсорбентов вели при 100°С.
2
1
1
0
0
адсорбции гемоглобина как минимум по двум механизмам — в устьях пор (УП) и на поверхности кремнезема. Очевидно, что общая поверхность кремнеземов, доступная для адсорбции гемоглобина ^ОБ, представляет собой сумму внутренней поверхности ^ВП (вну
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.