БИОФИЗИКА, 2012, том 57, вып. 1, с. 115-119
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 611.018.26.085.23:577.344.3
КИНЕТИКА ИЗМЕНЕНИЙ ОПТИЧЕСКОГО КОЭФФИЦИЕНТА ПPОПУСКАНИЯ ЖИPОВОЙ ТКАНИ in vitro КАК PЕЗУЛЬТАТ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
© 2012 г. В.А. Дубровский, И.Ю. Янина*, В.В. Тучин* **
Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского, 410026, Саратов, ул. Б. Казачья, 112; E-mail: mbf@sgmu.ru
*Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, 410012, Саратов, ул. А страханская, 83; **Институт проблем точной мех аники и управления РАН, 410028, Саратов, ул. Рабочая, 24
Поступила в p едакцию 01.03.10 г. После доработки 19.10.10 г.
Экспериментально обнаружено изменение оптического коэффициента пропускания жировой ткани человека в результате фотодинамического воздействия. На основе статистической обработки цифровых микрофотографий тонких образцов ткани количественно оценена кинетика процессов в жировой ткани. П редложен возможный механизм наблюдаемых эффектов -липолиз жировых клеток с сохранием их структуры и отсутствием деструкции.
Ключевые слова: фотодинамическое действие, клетки жировой ткани, статистическая обработка цифровых фотографий.
Фотобиология животной клетки является молодым и активно развивающимся направлением биологии. Одним из объектов ее исследования являются клетки жировой ткани. Фотовоздействие на жировую ткань обсуждено, например, в работах [1-6]. Комбинированному действию температуры и освещения на жировую ткань посвящены работы [7,8]. Подобные исследования представляют интерес как с теоретической точки зрения - изучение механизма светового действия на клетки, в том числе жировые, так и с прикладной - для различного рода медицинских приложений, например, фототермической и фотодинамической терапии.
Цель данной работы - экспериментальное изучение кинетики пр оцессов в сенсибилизиро -ванных красителем клетках жировой ткани in vitro после их фотооблучения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служила подкожная жировая ткань человека, извлеченная после хирургической пластической опер ации. Для изготовления тонких срезов жировой ткани толщиной порядка 100-150 мкм (только при таких толщинах представляется возможным ее мик-рофотогр афирование в проходящем свете) ткань предварительно замораживали в течение 1 сут. П р иготовленный образец (срез) заморо -
женной жир овой ткани размещали на предмет -ном стекле микроскопа, окрашивали спирто-водным раствором (1%) бриллиантового зеленого с концентрацией 6 мг/мл в течение 10 мин. Затем образец термостабилизировали в жидкостном термостате ТЖ-ТС-01 (точность поддер жания заданной темпер атуры составляла ± 0,1°С) [9]. Чер ез 30-50 мин, когда темпер атура образца достигала заданного значения (в диапазоне от 37 до 43°С), проводили микрофото-графир ование образца. Далее образец в течение заданного времени облучали светодиодной лампой (Ultra Lume Led 5, W = 70 мВт/см2 при X = 442 нм и W = 121 мВт/см2 при X = 597 нм), которую размещали вплотную к образцу. Диаметр светового пятна составлял 2 мм. Длительность облучения варьировали в пределах 3-15 мин. Эффективность фотодинамического действия обеспечивалась совпадением спектра излучения лампы со спектром поглощения бриллиантового зеленого.
По окончании облучения образцы фотогра -фировали через каждые 5 мин.
Работа цифр овой фотокамер ы поддер жива-лась программой Aver Media EZ СарШге, далее цифровые фотографии клеток передавались на персональный компьютер. Запись файлов изображений осуществлялась в формате BMP. Ста-
115
8*
Рис. 1. Фотография сенсибилизированной жировой ткани при температуре 41°С до ее фотооблучения (обозначены зоны ткани для их статистической обработки).
тистическую обработку результатов пр оводили с помощью программ МаШСаё и 81аЙ81;1са.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В предва рительных экспериментах было показано, что в отсутствие фотовоздействия коэффициент пропускания ткани за время наблюдения не изменялся. Изменения этого коэффициента не наблюдали и при воздействии на обр азец каждого изучаемого фактор а отдельно: только красителя, либо только повышения температуры в диапазоне 37-43°С (время наблюдения 1 ч), либо облучения светодиодной лампой в течение 5 мин при температуре 37°С. Однако комбинированное воздействие на жировые клетки, предварительно фотосенсибили-зированные световым излучением и повышенной температур ой в диапазоне 37-43°С, приводило к видимым изменениям в структуре ткани. П ри этом максимальное изменение оптического коэффициента пр опускания образцов пр оисхо -дило в диапазоне температуры 39-43 °С и длительности облучения в течение 10-15 мин.
Анализ особенностей этого эффекта показал, что срезы жировой ткани не являются монослоями (рис. 1). Оценки показали, что размер ы жировых клеток в среднем составляют
Рис. 2. Фотографии структуры выбранных зон (рис. 1) в зависимости от времени инкубации биоткани.
50-80 мкм, что согласуется с данными, полученными в работе [10].
Фотографии пяти зон исследуемой жировой ткани (рис. 1) при разных временах инкубации приведены на рис. 2; эти зоны выбраны для дальнейшей статистической обработки и анализа. Под тер мином «вр емя инкубации» будем понимать интервал времени от момента окончания фотовоздействия на биообъект до момента фотографирования. Размер каждой зоны на цифровых изображениях составлял 90 х 90 пикселей (пкс), 1 пкс соответствовал примерно 2 мкм. По отдельным кадрам, приведенным на рис. 2, можно проследить пространственно-временные изменения структуры ткани:
- световое облучение сенсибилизированной жировой ткани приводит к изменению ее структуры;
- до 40-60 мин структура жировой ткани изменяется не столь заметно, а затем это изменение становится более существенным;
- после 80 мин изменения структуры жировой ткани замедляются, ткань становится более однородной.
Кинетика изменений коэффициента пропускания жировой ткани после фотодинамического действия. С точки зрения оптики, приведенные микрофотографии зон жировой ткани (рис. 2) можно рассматривать как распр еделение оптической плотности (т.е. оптического коэффициента пропускания Т) сенсибилизированного
биообъекта во времени и пространстве. При этом тр адиционно пр едполагается, что пр еоб -разование аналогового светового сигнала в цифр овой код о существляется линейным обр а -зом. Такой подход, естественно, сужает динамические пределы регистрируемых световых потоков. Поэтому мы пр едвар ительно снимали аналог световой характеристики фотокамеры В(Т), ко-тор ая включала в себя линейную часть (пр еделы изменения яр кости В от 1 до 130 единиц), а также кривую, соответствующую эффекту насыщения (В от 130 до 256 единиц яр кости). Эта характеристика аппроксимировалась полиномом третьей степени вида: В = -2,39 + 361Т + 37,75Т2 - 142,9Т3, где Т - коэффициент пр о -пускания нейтральных светофильтров, использованных для изменения величины светового потока. П р и этом световой поток о светитель-ной лампы микр о скопа подбир ался таким, чтобы в отсутствие светофильтр ов (Т = 100%) величина яр кости со ставляла: В = 256. Компьютер ное пр еобр азование найденной аппр окси-мации В(Т) в зависимость Т(В) позволяет установить калибр овочную кр ивую, по котор ой каждому измер енному значению яр кости В можно поставить в соответствие коэффициент пр опускания биообъекта Т. Е стественно, учитывая спектр поглощения бриллиантового зеленого, измер ения коэффициентов пр опускания нейтр альных светофильтр ов пр оводили вблизи максимума поглощения кр а сителя (к = 597 нм). Такой подход пр едставляется вполне коррект -ным, и в то же вр емя он позволяет расшир ить динамический диапазон регистр ируемых световых потоков. Все последующие расчеты пр оводили с учетом найденной калибр овочной кр ивой, аппр оксимир ованной полиномом Т = -0,01574 + 0,00478В - 2,6-10-5 В2 + 8,910-8 В3.
Из рис. 2 видно, что в анализир уемы х зонах с течением вр емени изменяется не только абсолютное значение коэффициента пр опускания Т, но и его пр о стр анственное р аспр еделение. Можно пр едположить, что уср едненное по площади зоны фотокадр а значение Тср несет ин-фо р мацию об интегр альной динамике пр оцес-сов, пр оисходящих в сенсибилизир ованной облученной жир овой ткани. В то же вр емя величина среднего квадратичного отклонения а(Т) от Тср для данной зоны хар актеризует пр о -стр анственное р а спр еделение коэффициента пр опускания, а следовательно, стр уктур у ткани в зоне и ее вр еменное изменение.
Для каждой из пяти выбранных зон (рис. 2) были р ассчитаны значения Тср и а(Т) в за -висимости от вр емени инкубации г (всего 30 пар значений пар аметр ов). В качестве пр имер а на рис. 3 приведены результаты расчетов Тср
Рис. 3. Зависимости ср еднего значения коэффициента пропускания Тср и его отклонения а(Т) от вр емени инкубации биоткани г для 2-й зоны (р ис. 1): темные квадр аты - экспер иментальные значения Тср; сплошная линия - полиномиально аппр оксимир ованные значения Тср(г) = - 1,6-10-5г2 + 0,003г + 0,5; пунктир ные линии - нижняя и верхняя гр аницы зависимости а(Т) от вр емени инкубации (кружки и тр еугольники - соответствующие экспер именталь-ные точки).
и а(Т) для втор ой зоны. Полиномиальная аппр оксимация экспер иментальной зависимо сти Тср(г) имеет вид: Тср(г) = Аг2 + Сг + В, где для второй зоны А = -1,610-5; С = 0,003; В = 0,5.
Значения среднего квадратичного отклонения а(Т) для р азных моментов вр емени г р ас-полагаются симметрично относительно экспериментальных значений Тср, а функция а(Т) показана пунктирными линиями по обе сторо -ны относительно аппроксимации Т (г). Для остальных четырех зон графики и функции Тср и а(Т) от вр емени инкубации г оказались близкими к пр едставленным на рис. 3. Так, значения величин А ср, С ср и В ср по пяти зонам со ставили: 8,4-10-6 пр и аА = -2,4-10-6; С ср = 0,002 пр и аС = 0,0004; В ср = 0,5 пр и аВ = 0,03. Из рис. 3 видно, что:
- пр оцесс, запущенный фотодинамическим действием на жир овую ткань, но сит нелинейный хар актер и пр актически идентичен для различных зон биоткани;
- величина а(Т) в зависимо сти от вр емени инкубации
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.