КИНЕТИКА И КАТАЛИЗ, 2014, том 55, № 2, с. 157-162
УДК 535.379:541.14:577.3
КИНЕТИКА ОКСИ-ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ЭТИЛБЕНЗОЛА В ПРИСУТСТВИИ АНТИОКСИДАНТОВ ИЗ ТКАНЕЙ МОРСКОГО БЕСПОЗВОНОЧНОГО ЕиРЕШАСТА ЕЯАииАТШХ. ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ
© 2014 г. Р. Ф. Васильев1, Т. Л. Вепринцев1, Л. С. Долматова2, *, В. В. Наумов1, А. В. Трофимов1, **, Ю. Б. Цаплев1
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН, Владивосток
*Е-таП: dolmatova@poi.dvo.ru **Е-таИ: avt_2003@mail.ru Поступила в редакцию 14.05.2013 г.
Экстракты из тканей голотурии Eupentacta fraudatrix ослабляют окси-хемилюминесценцию этил-бензола в хлорбензоле, инициированную термолизом азо(бис)изобутиронитрила и усиленную переносом энергии на 9,10-дибромантрацен. Причиной уменьшения скорости хемивозбуждения в реакции пероксидных радикалов друг с другом является перехват радикалов антиоксидантами, содержащимися в экстрактах. По кинетике хемилюминесценции оценены концентрации антиоксидантов в экстрактах и константы скорости их реакции с пероксидными радикалами.
DOI: 10.7868/S0453881114020154
Окисление органических веществ, а также материалов и препаратов на их основе, часто является нежелательным процессом. В технической химии для защиты от окисления используют анти-оксиданты, которые перехватывают пероксидные радикалы — носители цепи окисления. В живых организмах аналогичную задачу решают биоан-тиоксиданты и специальные ферментативные системы, созданные в ходе эволюции. Поиск и изучение природных антиоксидантов — актуальная задача современной биохимии [1—3].
Известно, что ткани морских беспозвоночных из группы вторичноротых, относящихся к типу иглокожих (ЕсЫтоёегта1а) и принадлежащих классу голотурий (Ио1о1Ыигю1ёеа), содержат ли-пиды, а также гликозиды, каротиноиды, проста-гландины, витамины и другие биологически активные вещества. Экстракты голотурии обладают выраженным эффектом в лечении ряда кожных заболеваний и противоожоговым действием [4]. Несмотря на то, что ткани голотурии содержат ненасыщенные липиды, окисляются они удивительно медленно, что может быть связано с присутствием в тканях эффективных антиоксидан-тов. Целью нашей работы была проверка этого предположения.
Ранее для исследования антиоксидантных свойств химических соединений были предложе-
ны разнообразные модельные химические процессы [2]. Часть их ориентирована на водорастворимые антиоксиданты, другие — на антиоксидан-ты в слабополярных средах. Среди последних особое место занимает окисление молекулярным кислородом углеводородов, например, этилбен-зола (RH) [5—7]. Эта реакция подробно изучена и многократно опробована для исследования анти-оксидантов газоволюметрическим и хемилюми-несцентным методами [8—12].
В данной работе антиоксидантную способность экстрактов, полученных из тканей голотурии Eupentacta fraudatrix исследовали хемилюми-несцентным методом.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Голотурии собирали в бухте Восток Японского моря. Экстракты получали из гомогенизатов тканей целых животных с последующим высушиванием согласно методике [4]. Навеску сухого экстракта растворяли в хлорбензоле. Аликвоту раствора вводили в смесь, состоящую из растворов этилбензола в хлорбезоле (20—30 об. %), инициатора — азо(5ис)изобутиронитрила (AIBN) и усилителя хемилюминесценции (ХЛ) — 9,10-дибромантра-цена (DBA). Суммарный объем реакционной смеси составлял 4.2—4.4 мл. Реакционным сосудом слу-
Рис. 1. Спектр поглощения раствора биопрепарата (1) в хлорбензоле и исправленные спектры фотолюминесценции DBA в хлорбензоле в присутствии биопрепарата (2—7) при его концентрациях, г/л: 0 (2), 0.19 (3), 0.37 (4), 0.54 (5), 0.71(6) и 1.32 (7).
жила термостатированная при 50°C цилиндрическая стеклянная кювета. Смесь барботировали воздухом для ее насыщения кислородом и перемешивания.
Кинетику ХЛ регистрировали хемилюмино-метром [10], собранным на основе цифрового счетчика фотонов Hamamatsu Н7467 ("Hamamat-su", Япония) и персонального компьютера. Длительность интервалов счета составляла 0.5 с. Спектры поглощения измеряли на спектрофотометре Lambda 25 ("Perkin Elmer", США), спектры флуоресценции — на спектрофлуориметре LS55 ("Perkin Elmer", США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При окислении этилбензола ХЛ возбуждается в экзотермическом акте диспропорционирования пероксидных радикалов, и первичной хемивоз-бужденной частицей является продукт этой реакции — кетон (ацетофенон) в триплетном состоянии. Излучательный триплет-синглетный переход (T1—S0) запрещен, так как идет с изменением спина, и прямая ХЛ крайне слаба. Ее усиливают посредством межмолекулярного переноса энергии с уровня T1 кетона на синглетный возбужденный уровень S1 эффективного флуорофора, добавляемого в систему (в данной работе — DBA). Благодаря влиянию тяжелого атома Br, усиливающего спин-орбитальное взаимодействие в DBA, "запрещенный" перенос энергии идет с высокой константой скорости (близкой к диффузионной). В результате слабая фосфоресценция T1—S0 пер-
вично хемивозбужденного кетона заменяется на сильную флуоресценцию S1—S0 DBA [13, 14]. Испускание молекул DBA сосредоточено в области 410—480 нм (рис. 1), которая соответствует максимальной чувствительности фотоумножителей с многощелочным катодом. Таким образом, действие всех указанных факторов повышает чувствительность и надежность измерения ХЛ.
Перехват радикала ROO* антиоксидантом (АОН) тушит ХЛ. Затем, по мере потребления ан-тиоксиданта, восстанавливаются как стационарная концентрация ROO*, так и интенсивность ХЛ. Изучение кинетики ХЛ позволило определить концентрацию и реакционную способность антиокси-дантов. Данные по химическим и фотофизическим процессам, составляющим схему окисления RH, представлены в табл. 1. Константа скорости реакции 7 (k7) является искомой величиной.
Скорость инициирования (W) определяли по формуле:
W = fkotAIBN], (1)
где /кл = 0.60 — эффективность выхода первичных радикалов из клетки, а константа скорости распада k0 = 1.58 х 1015 exp(—30.8 ккал/RT) слабо зависит от растворителя [15].
При [AIBN] = 2.5 х 10-3 моль л-1 и температуре 323 K значения k0 и W составили 1.9 х 10-6 с-1 и 1.2 х 10-8 моль л-1 с-1 соответственно. Известны и другие формулы для вычисления константы скорости распада AIBN и скорости инициирования [16]. Они дают разброс значений ~30%. Результаты определения концентраций антиоксидантов и
КИНЕТИКА ОКСИ-ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ЭТИЛБЕНЗОЛА 159
Таблица 1. Схема реакций инициированного окисления RH в присутствии АОН и DBA
Реакции Константа скорости, с 1 Стадия
Мономолекулярная реакция AIBN ^ ^ г' O2——> R. ~1.9 x 10-6 Инициирование окисления
Бимолекулярные реакции1 Константа скорости, л моль-1 с-1
1. R* + O2 ^ ROO' 1.7 x 106 Продолжение цепей
2. ROO' + RH ^ ROOH + R' 1.7 »
6. ROO' + ROO' ^ ROH + O2 + R-H=O 107 Обрыв цепей при диспропорционирова-нии радикалов
6*. ROO' + ROO' ^ ROH + O2 + R-H=O* Ф* x 107 Хемивозбуждение продукта (ацетофено-на) при обрыве цепей. Ф* ~ 0.003
7. ROO' + AOH ^ ROOH + AO' - Ингибирование окисления
8. ROO' + AO' ^ NRP 5 x 108 Обрыв цепей
9. AO' + AO'^ NRP 103 Фотофизические процессы Ингибирование окисления
R-H=O* ^ R-H=O + hv1 - Испускание первичной ХЛ
R-H=O* + DBA ^ R-H=O + DBA* 108 Перенос энергии на DBA
DBA* ^ DBA + hv2 - Испускание усиленной ХЛ
1 — нумерация стадий реакции соответствует обозначениям, принятым в работе [5],
г* — свободный радикал, образующийся при распаде инициатора,
R* — радикал этилбензола,
R-H — бирадикал этилбензола,
NRP — нереакционноспособный продукт,
Ф* — выход хемивозбуждения.
k7 имели среднюю относительную ошибку ~10%. Поэтому полученные в работе численные данные следует рассматривать как оценочные значения для довольно сложной композиции веществ, выделенных из природного объекта, а не для индивидуального соединения.
На рис. 2 показана кинетика ХЛ до и после введения в реакционную смесь 4.4 мкмоль л-1 "классического" антиоксиданта а-токоферола. Его свойства хорошо изучены, и он часто используется в качестве стандарта. Видно, что интенсивность (I) ХЛ сразу после введения антиоксиданта резко снижается, затем, по мере его расходования, восстанавливается до начального уровня (I0). Время полувосстановления ХЛ, когда I становится равной половине I0, называют "периодом индукции" (т0.5) [8, 9]. В периоде индукции радикалы ROO * появляются с W¡ и гибнут исключительно на антиоксиданте AOH и его радикале AO* (реакции 7 и 8). Поэтому AOH потребляется приблизительно с постоянной скоростью, составляющей f[AOH]0/x0.5, где f — стехиометриче-ский коэффициент ингибирования, равный среднему количеству актов обрыва цепей окисления,
приходящихся на одну молекулу антиоксиданта. Из соотношения Щ = /[АОИ]0Д05 можно оценить исходную концентрацию вводимого в раствор антиоксиданта:
[АОНЬ = Т0.5 (2)
Для а-токоферола f = 2, поэтому [АОН]0 = 5. Например, для кинетической кривой Т (рис. 2) т05 = 680 с, Щ = 1.2 х 10-8 моль л-1 с-1 и [АОН]
0 = 4.1 мкмоль л 1, что удовлетворительно согласуется с начальной концентрацией а-токо-ферола. Максимальный наклон кинетической кривой 1/10 на участке восстановления ХЛ (в точке 1/10 = 0.5) зависит от скорости инициирования и констант скорости 2к6 и к7 [6-11]:
[ё(///0)/^]тах = 0.22к7(Щ;/2к6)1/2. (3) При известных Щ и 2к6 (для этилбензола 2к6 = 1 х 107 л моль-1 с-1 [16]), соотношение (3) позволяет из кинетической кривой определить к7. Важно отметить, что максимальный наклон не связан с начальной концентрацией антиоксиданта (ибо на этом, заключительном, участке реакции исчезают последние порции антиоксиданта, и не имеет значения, сколько его было вначале). Та-
0
500
1000
1500 t, c
Рис. 2. Кинетика ХЛ при введении в реакционную смесь а-токоферола (T) и образцов биопрепарата различной концентрации, г/л: 0.82 (1), 2.42 (2). Условия реакции: [AIBN] = 2.5 х моль/л, [а-токоферол] = = 4.4 мкмоль/л, [DBA] = 2.0 х 10-4 моль л-1, W¡ = 1.2 х х 10-8 моль л-1 с-1, 50°C.
ким образом, получаем к7 = 2.9 х 106 л моль-1 с-1, что практически совпадает с литературным значением для а-то
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.