ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 2, с. 197-204
= ЭКОЛОГИЯ
УДК 574.24.581.133:582.172
КИНЕТИКА ПОГЛОЩЕНИЯ ФОСФАТОВ И НИТРАТОВ МОРСКОЙ МНОГОКЛЕТОЧНОЙ ВОДОРОСЛЬЮ
Gelidium latifolium (Grev.) Born. et Thür
© 2007 г. В. Ä. Силкин*, И. Н. Чубчикова**
*Южное отделение Института океанологии РАН, 353467 Геленджик **Институт биологии южных морей НАН Украины, 99011 Севастополь, просп. Нахимова, 2
E-mail: vsilkin@mail.ru Поступила в редакцию 14.07.2005 г.
Исследована нестационарная кинетика поглощения фосфатов и нитратов красной морской водорослью Gelidium latifolium (Grev.) Born. et Thur. и рассчитаны константы уравнения Михаэлиса-Ментен для этих элементов. Показано, что в области концентраций 0-3 мкмоль кинетика поглощения фосфатов имела следующие значения коэффициентов: максимальная скорость поглощения 0.8 мкмоль/(г ч), константа полунасыщения 1.745 мкмоль. Для нитратного азота в области концентраций 0-30 мкмоль отмечена адаптивная стратегия кинетики поглощения с изменением во времени параметров уравнения: после первого часа максимальная скорость поглощения была 5.1 мкмоль/(г ч), а константа полунасыщения 19 мкмоль, через два часа наблюдали существенное повышение максимальной скорости поглощения. Это могло быть связано с синтезом нитратре-дуктазы. Сопряженная с процессом поглощения нитратов нестационарная кинетика выделения нитритов в окружающую среду имела одновершинный характер: значение максимума концентрации нитритов в среде, а также время его достижения увеличивалось при повышении первоначальной концентрации нитратов. Максимальная концентрация нитритов составляла 6-14% от первоначальной концентрации нитратов в среде.
Макрофиты могут поглощать элементы минерального питания при помощи механизма активного транспорта, который следует кинетике Ми-хаэлиса-Ментен (Haines, Wheeler, 1978; Hanisak, Harlin, 1978; Topinka, 1978; Phillips, Hurd, 2004; Силкин, Хайлов, 1988; Силкин и др., 1992)
V =
VC
max
( K + C )
(1)
С - концентрация элемента в среде, мкмоль; V и Vmax - удельная и максимальная удельная скорости поглощения элемента, мкмоль/(г ч); Kc - константа полунасыщения, равная концентрации элемента при V = Vmax/2, мкмоль.
К настоящему времени накопились данные, указывающие на существование двухфазного механизма поглощения элементов минерального питания. Считается, что первая фаза поглощения, функционирующая при низких концентрациях, носит активный характер; вторую фазу чаще объясняют простой диффузией через мембрану (Lobban, Harrison, 1997). Однако накопленный экспериментальный материал не всегда однозначно подтверждает это. Так обнаружено, что поглощение фосфора морской водорослью Palmaria palmata следует двухфазной модели: при низких концентрациях удельная скорость поглощения может описываться зависимостью Миха-
элиса-Ментен, при высоких - линейной моделью (Martinez, Rico, 2004). Поглощение всех форм азота следует только однофазной кинетике активного поглощения. Есть примеры трехфазной модели поглощения фосфора макрофитами, при этом первые две фазы носят насыщающий характер, а третья - линейный (Friedlander, Dawes, 1985). При поглощении нитратов макрофитами также отмечена двухфазная модель (Conolly, Drew, 1985; La-very, McComb, 1991). Отсюда следует, что проблема определения кинетических параметров поглощения носит нетривиальный характер - для каждой водоросли и для определенных условий необходимо оценивать не только константы поглощения, но и определять механизм и, как следствие, вид зависимости удельной скорости поглощения.
Очевидно, что константы Vmax и Kc уравнения (1) зависят от условий среды, а именно: температуры, освещенности и др., а также от физиологического состояния исследуемого организма. Для объективной оценки этих констант необходимо, чтобы условия эксперимента для разных видов были одинаковыми. Другая проблема заключается в методе оценки удельной скорости поглощения элемента в среде.
Существуют два способа нахождения зависимости V(C). Первый основан на измерении скорости
Рис. 1. Зависимость удельной скорости поглощения фосфатов красной водорослью Gelidium latifolium от их концентрации в среде: 1 - экспериментальные данные; 2 - зависимость Михаэлиса-Ментен для всей совокупности данных; 3 - для совокупности данных без точек при концентрации 3.77 мкмоль.
усвоения элемента при различных начальных концентрациях элемента в среде. При втором задается достаточно большая начальная концентрация элемента в среде; измерения проводят через дробные промежутки времени и по мере исчерпания элемента в среде получают последовательность значений Ci и Vi что позволяет построить функцию V(C). Есть экспериментальные данные, указывающие на то, что при втором способе с течением времени экспозиции могут изменяться не только параметры поглощения, но и характер зависимости удельной скорости поглощения от концентрации элемента в среде (Martinez, Rico, 2004).
Способность водорослей выделять нитриты при поглощении нитратов является слабо изученным вопросом. Знание кинетических закономерностей выделения и поглощения нитритов необходимо как для понимания процессов биотрансформации нитратов в нитриты в прибрежных зонах с высокой плотностью макрофитных зарослей, так и при организации минерального питания в промышленной культуре водорослей.
Цель работы состояла в определении характера зависимости удельной скорости поглощения от концентрации элемента в среде, а также в оценке кинетических параметров поглощения фосфатов и нитратов и сопряженного с этим выделения нитритов красной морской многоклеточной водорослью Gelidium latifolium (Grev.) Born. et Thur. с использованием обоих вышеупомянутых методов, а также в исследовании закономерностей изменения этих параметров во времени.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования - красная морская водоросль Gelidium latifolium (Grev.) Born. et Thur. была собрана в Севастопольской бухте на глубине 0-0.5 м. После тщательной очистки от эпифитов навеску водорослей 25 г сырой биомассы помещали в 4-литровые стеклянные стаканы с морской водой, взятой в 18 км от берега, что обеспечивало чистоту воды и низкую, близкую к нулю, концентрацию азота и фосфора. Водоросли содержали при освещении люминесцентными лампами (освещенность около 30 Вт/м2 ФАР), перемешивание осуществляли продувкой воздуха, смену воды производили раз в сутки. Данные образцы служили исходным материалом для проведения экспериментов.
Для изучения влияния концентрации элементов питания в среде на скорость их поглощения образцы 4 г сырой биомассы водоросли, что соответствовало 1.13 г сухой биомассы, помещали в систему культивирования с регуляцией световых и температурных условий. Объем среды в фото-биореакторе составлял 1 л. Перемешивание осуществлялось сжатым воздухом. Обеспечивали следующие начальные концентрации элементов питания в среде: фосфатов 0-14.44 мкмоль при отсутствии азота, нитратов 0-71.43 мкмоль при отсутствии фосфора. В качестве источников элементов использовали NaNO3 и Na2HPO4 ■ 12H2O. Интенсивность света на поверхности жидкой фазы составляла 30 Вт/м2 ФАР, температура 20 ± ± 2°С, время экспозиции 5 ч. Пробы среды отбирали каждый час.
Содержание фосфора определяли по методу Мерфи-Райли, нитритов - с реактивом Грисса, нитратов - методом восстановления нитратов до нитритов в кадмиевой колонке (Методы ..., 1988). Параметры Vmax и Kc уравнения (1) определяли в
координатах Лайнуивера-Берка (V ~ ^).
Статистическую обработку результатов производили с использованием доверительной вероятности 0.90.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Кинетика поглощения фосфатов. Зависимость удельной скорости поглощения от концентрации фосфора в среде имеет характер кривой, схожей с таковой уравнения Михаэлиса-Ментен (рис. 1). Однако обращает на себя внимание тот факт, что график зависимости V(C) проходит не через начало координат, а существует определенная концентрация С0, ниже которой удельная ско-
Vpo , мкмоль/(г ч) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
^PO-, мкмоль/(г ч)
0.127 C™ - 0.1181
PO
20
мкмоль/л
15 20
NO3
30 35 мкмоль/л
Рис. 2. Зависимость удельной скорости поглощения фосфатов красной водорослью Gelidium latifolium от их концентрации в среде и аппроксимация данных с помощью гиперболической и линейной функций после первого часа экспозиции. 1 - экспериментальная точка из серии опытов, приведенных на рис. 1; 2 - совокупность экспериментальных данных для высоких концентраций фосфатов; 3, 4 соответствуют кривым 2, 3 на рис. 1; 5 - линейная зависимость, которая аппроксимирует экспериментальные данные для поглощения фосфатов в области их высоких концентраций.
рость поглощения равна нулю. Уравнение, таким образом, имеет вид
у _ Vmax( С С о )
_ Kc + (С - Со) •
(2)
Для данных экспериментов константа С0 оказалась близкой 0.24 мкмоль; с учетом этого значения были рассчитаны параметры уравнения (2).
Если объединить все данные, полученные в эксперименте, поглощение соответствует 1.75 мкмоль/(г ч) для максимальной скорости поглощения и 5.1 мкмоль для константы полунасыщения (рис. 1). Поскольку при высоких концентрациях фосфатов зависимость удельной скорости поглощения от концентрации в среде может следовать либо линейной функции, либо гиперболической (в случае двухфазной кинетики) необходимо изучить ее в дополнительных экспериментах. Действительно, если исключить из данных точки за первый и второй час поглощения фосфатов при начальной его концентрации 3.77 мкмоль, то можно обнаружить, что все остальные точки укладываются в кривую Михаэлиса вне зависимости от часа экспозиции. Такая кривая имеет следующие параметры: максимальная удельная скорость поглощения 0.8 мкмоль/(г ч), константа полунасыще-
Рис. 3. Зависимость удельной скорости поглощения нитратов красной водорослью Gelidium latifolium от их концентрации в среде. 1 — после 1-го ч экспозиции; 2 - после 2-го ч; 3 — после 3-го ч; 4 — после 4-го ч; 5, 6 -аппроксимация данных для поглощения после 1-го и 2-го ч экспозиции.
ния 1.745 мкмоль. При концентрации фосфатов выше 3 мкмоль механизм активного поглощения с вышеприведенными константами заменяется другим. Про
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.