научная статья по теме КИНЕТИКА СВЯЗЫВАНИЯ [3H]ПРАЗОСИНА И [3H]ДИГИДРОАЛПРЕНОЛОЛА С 1- И -АНДРЕНОРЕЦЕПТОРАМИ МЕМБРАН КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС Биология

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 6, с. 465-471

УДК 576314.6.088.6+612.11.612.82.015

КИНЕТИКА СВЯЗЫВАНИЯ [3Н]ПРАЗОСИНА И [3Н]ДИГИДРОАЛПРЕНОЛОЛА С а1- И Р-АНДРЕНОРЕЦЕПТОРАМИ МЕМБРАН КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

© 2007 г. Л. А. Нестерова, Б. Н. Манухин

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26; факс (495)1358012, электронная почта: manukhinb@mail.ru Поступила в редакцию 25.04.2007 г.

На синаптосомных мембранах головного мозга крыс исследовано связывание неселективных антагонистов а1-адренорецепторов [3Н]празосина и Р-адренорецепторов [3Н]дигидроалпренолола. Установлено, что лиганд-рецепторное взаимодействие а1-адренорецепторов соответствует модели один пул рецепторов и присоединение двух молекул лиганда к одному рецептору. Параметры связывания [Н]празосина - КА = 2.58 ± 0.20 нМ, Вт = 2.95 ± 1.12 фмоль/мг белка, п = 2. Лиганд-рецеп-торное взаимодействие Р-адренорецепторов соответствует модели два пула рецепторов в одной эф-фекторной системе и присоединение двух молекул лиганда к одному рецептору. Параметры связывания [3Н]дигидроалпренолола - КЙ1 = 0.74 ± 0.09 нМ, Кй2 = 7.63 ± 0.70 нМ, Вт1 = 25 ± 2 фмоль/мг белка, Вт2 = 48 ± 2 фмоль/мг белка п1 = 2, п2 = 2. Предполагается, что а- и Р-адренорецепторы в мембранах головного мозга крыс существуют в виде димеров.

Первый этап в действии на эффекторную клетку сигнальной молекулы (нейротрансмиттера, гормона, пептида или другой активной молекулы) - ее присоединение к специфическому рецептору. Присоединение молекулы лиганда к рецептору, которое определяется с помощью радиоактивных ли-гандов - первый не опосредованный этап лиганд-рецепторного взаимодействия. В этом случае выявляется общее количество рецепторов (Втах) и их сродство (К). Этот процесс неоднократно теоретически и экспериментально анализировали с помощью энзиматических [1, 2] и радиолигандных [3-6] экспериментов. Поскольку эти реакции подчиняются сходным закономерностям, успехи, достигнутые в анализе каждого из этих процессов, могут с определенными ограничениями использоваться при изучении действия биологически активных веществ на уровнях от субклеточного до организ-менного. В каждой новой публикации на эту тему делается еще один шаг в расшифровке закономерностей лиганд-рецепторного взаимодействия - основной реакции в работе регуляторных систем организма [7-9].

Стандартные методы анализа лиганд-рецеп-торных взаимодействий не всегда дают удовлетворительные результаты, поскольку учитывают не все особенности связывания лиганда с рецептором. Поэтому предложены простые математические модели (уравнения) для более подробной характеристики специфических рецепторов, их сродства, количества в исследуемой системе и числа молекул радиоактивного лиганда, связывающихся с одним рецептором. Параметры уравнений показыва-

ют количество пулов рецепторов, различающихся по сродству (K) к лиганду, число активных рецепторов (Bmax = Bm1 + Bm2), коэффициент Хилла (n, ко-оперативность, димеризация рецепторов или количество молекул лиганда, связывающихся с рецептором) [6, 10]. С помощью этих моделей в настоящей работе получены количественные характеристики функциональной активности и закономерностей присоединения радиоактивных лигандов [3Н]празо-сина и [3Н]дигидроалпренолола к а1- и в-адреноре-цепторам мембран коры головного мозга крыс.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Опыты проводили на синаптосомных мембранах коры головного мозга крыс-самцов линии Ви-стар (210-250 г), которые выделяли по описанному ранее методу [11] с некоторыми модификациями [12]. Готовые мембранные препараты хранили при -70°С в течение 3 нед. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [13], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин ("Sigma", США). Радиолигандный анализ проводили по общепринятому методу [14]. Объем инкубационной среды составлял 200 мкл - 100 мкл суспензии мембран, 100 мкл буфера, вытеснитель и лиганд. Смесь инкубировали 30 мин при 25°С. Реакцию связывания останавливали добавлением 1 мл холодного буфера (0°С). Для определения параметров связывания лиганда с агадренорецепторами использовали специфический неселективный антагонист ах-адренорецепторов [3Н]празосин ([3H]pra-zosin, "Amersham", Великобритания, 77 Ки/мМ) в концентрациях 0.33-9.90 нМ, с в-адренорецепто-

рами - специфический неселективный антагонист [3Н]дигидроалпренолол ([3Н^НА) ("Ате^ат", 38 Ки/мМ) в концентрациях 0.5-20 нМ. Специфическое связывание лигандов определяли по разнице между общим и неспецифическим связыванием в присутствии вытеснителя празосина для а1-адре-норецепторов и алпренолола для в-адренорецеп-торов в концентрации 100 мкМ. Закономерности связывания антагонистов со специфическими рецепторами определяли с использованием математических и графических методов анализа лиганд-рецепторных взаимодействий.

Ранее теоретически и экспериментально было показано, что взаимодействие специфических радиоактивных антагонистов адрено- и мускарино-вых рецепторов с изолированными мембранами коры мозга крыс описывается уравнениями для одного или двух пулов рецепторов [12]:

Ь = [(БтАЖ К"Л1 + Л")], (1)

Ь = [ВтИ^МК+ Л"1)] + [(Вт2Л"2)/(+ Л"2)], (2)

где Ь - количество связанного лиганда, Вт1 и Вт2 -количество мест связывания лиганда в высоко- и низкоаффинном пулах рецепторов в одной эффек-торной системе с константами диссоциации Кй1, Кй2 и коэффициентом Хилла п1, п2, [А] - концентрация лиганда в инкубационной среде. Действие каждого из исследованных веществ анализировали с использованием семи математических моделей ли-ганд-рецепторного взаимодействия [10].

Модели: I - один пул рецепторов с рассчитанными параметрами Вт1; КА1 и заданной величиной п1 = 1; II - один пул рецепторов с рассчитанными параметрами Вт1;Кй1, п1; III - один пул рецепторов с рассчитанными параметрами Вт1; КА1 и заданной величиной п1 = 2; IV - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Вт1; Кй1, и Вт2; К^2 и заданной величиной п1 = п2 = 1; V - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Вт1; Кй1, п1 и Вт2; КЛ2, п2 (п1 = п2); VI - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Вт1; Кй1, и Вт2; КА2, и заданной величиной п1 = п2 = 2; VII - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Вт1; Кй1, п1 и Вт2; КЛ2, п2(п1 Ф п2). Теоретически возможны и другие более сложные модели лиганд-рецепторного связывания, но их использование в данной работе не давало удовлетворительных результатов.

Поиск основных параметров лиганд-рецепторного взаимодействия - Кй1, КА2, Вт1, Вт2, п1 и п2 проводили с помощью компьютерной программы "SigmaPlot" по уравнениям (1) и (2) при числе итераций не менее 1000. Стандартная ошибка расчета приведена в таблицах. Полученные значения параметров использовали для построения теоретических кривых, приведенных на рисунках. Эффективность связывания лигандов с различными пулами рецепторов (Е) определяется выражением:

Е = Вт!2Кл. (3)

Эффективность является интегральным показателем, количественно характеризующим величину связывания лиганда при его концентрации, равной Kd (фмоль/мг белка/нМ) [10].

На рисунках приведены результаты конкретных опытов, а в таблицах средние результаты экспериментов. Теоретические кривые строили по уравнению (1) для одного пула рецепторов и по уравнению (2) для двух пулов. В опытах было по 711 точек, каждая с трехкратным повтором. Достоверность различий оценивали по критерию Стью-дента (p < 0.05). Все значения представлены как среднее арифметическое и средняя ошибка (M ± ± SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ

График специфического связывания [3Н]празо-сина изолированными мембранами коры головного мозга крыс представляет типичную кривую насыщения (рис. 1). Математический анализ экспериментальных данных показал, что наименьшие ошибки параметров и стандартной ошибки вычисления (Standard Error of the Estimate) получены при их расчете по уравнению (1) и модели III. Эта модель включает один гомогенный пул рецепторов и присоединение двух молекул лиганда к рецептору (табл. 1). По моделям IV-VII и уравнению (2) параметры математически не рассчитываются - очень большая ошибка или отрицательные величины параметров. Графический анализ экспериментальных данных с помощью уравнения (4), линеаризированной формы уравнения (1), в модифицированных координатах Скетчарда (b; b/A2) также соответствует существованию одного гомогенного пула а-адренорецепторов (рис. 2).

(b/A2) = [(Bml)/(Kh )] - [b/(Kli)]. (4)

Экспериментальные точки на графике расположены на прямой линии. Математический и графический анализ экспериментальных данных показали, что модель лиганд-рецепторного взаимодействия, предполагающая присоединение двух молекул лиганда к одному рецептору и включающая один пул рецепторов, наиболее соответствует полученным результатам (табл. 1). Для подтверждения соответствия полученным данным параметров, рассчитанных по уравнениям (1) и (4), построены теоретическая кривая (рис. 1) и линейная регрессия (рис. 2), которые достаточно хорошо совпадают с экспериментальными точками.

Связывание [3H]DHA ß-адренорецепторами изолированных мембран коры головного мозга крыс также описывается кривыми насыщения (рис. 3). Математический анализ экспериментальных данных по семи моделям и уравнениям (1) и (2) показал, что наименьшие ошибки в величинах параметров и стандартной ошибки вычисления полу-

b, фмоль/мг белка

А, нМ

Рис. 1. Экспериментальные точки и теоретическая кривая специфического связывания [3Н]празозина а^ адренорецепторами мембран коры головного мозга крыс. По оси абсцисс - концентрация [3Н]празосина (нМ), по оси ординат - количество мест, связанных ли-гандом (Ь, фмоль/мг белка). Теоретическая кривая рассчитана при значениях параметров: К = 2.17 нМ, Вт = 2.02 фмоль/мг белка.

b/A2, фмоль/мг/нМ2

b, фмоль/мг белка

Рис. 2. Экспериментальные точки и теоретическая кривая специфического связывания [3Н]празосина а^ адренорецепторами мембран коры головного мозга крыс. По оси абсцисс - количество мест связывания лиганда (Ь, фмоль/мг белка), по оси ординат - отношение количества мест связывания лиганда к квадрату его концентрации (Ь/А2, фмоль/мг/нМ2).

чены для модели

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.