МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 810-819
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА ^
УДК 575.852:577.124.2:579.864
КЛАСТЕР ГЕНОВ Thermotoga neapolitana, УЧАСТВУЮЩИХ В ДЕГРАДАЦИИ КРАХМАЛА И МАЛЬТОДЕКСТРИНОВ: ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ aglB И aglA В Escherichia coli, СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ
© 2003 г. Н. А. Лунина, О. В. Березина, Б. Вейс1, В. В. Зверлов, И. П. Воробьева, Л. А. Чекановская, И. С. Хромов, Г. Рааш1, В. Либель1, Г. А. Великодворская*
Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва, 123182 1Институт микробиологии и генетики, Университет Георга-Августа, Геттинген, D-37077, Германия
Поступила в редакцию 26.02.2003 г.
В работе субклонировали гены aglB и aglA из кластера генов утилизации крахмала и мальтодекст-ринов Thermotoga neapolitana в векторах pQE для экспрессии в клетках Escherichia coli. Рекомби-нантные белки AglB и AglA очищены практически до гомогенности и охарактеризованы. Оба фермента гипертермостабильны, оптимальная температура активности - 85°С. AglB представляет собой олигомерный белок, состоящий из идентичных субъединиц с мол. массой 55 кДа, склонных к агрегации. Он гидролизует циклодекстрины и линейные мальтодекстрины до глюкозы и мальтозы, отщепляя глюкозу с редуцирующего конца молекул, и является циклодекстриназой с а-глюкози-дазной активностью. Мощный ингибитор а-амилаз и а-глюкозидаз - акарбоза - не ингибирует AglB, а, напротив, полностью гидролизуется ферментом. Рекомбинантный AglB активируется в присутствии CaCl2, KCl и EDTA, а также после прогрева фермента. Рекомбинантный AglA представляет собой димер, состоящий из двух идентичных субъединиц с мол. массой 54 кДа. Он гидролизует а-гликозидные связи дисахаридов и коротких мальтоолигосахаридов, действуя на субстрат с нередуцирующего конца цепи. Это кофактор-зависимая а-глюкозидаза широкого спектра действия, гидролизующая как олигоглюкозиды, так и галактозиды с а-связями, т.е. фермент не специфичен по отношению к конфигурации углерода в позиции 4. Для активности фермента необходимо присутствие NAD+, DTT и Mn2+. Ферменты AglB и AglA дополняют друг друга по субстратной специфичности, обеспечивая полный гидролиз до глюкозы промежуточных продуктов, образующихся в процессе деградации крахмала.
Ключевые слова: геном, экспрессия генов, цикломальтодекстриназа, а-глюкозидаза, AglB, AglA, гипертермофилы, Thermotoga neapolitana.
Разнообразные мальтодекстрины, поступающие в клетку, гидролизуются внутриклеточными ферментами а-глюкозидазами. Большинство а-глюкозидаз ([К.Ф. 3.2.1.20], а-Б-глюкозид-глю-когидролаза, мальтаза) - это ферменты с экзо-функцией, расщепляющие а-1,4-гликозидные связи в мальтозе и линейных мальтоолигосахари-дах с нередуцирующего конца с освобождением а-глюкозы. За несколькими исключениями [1, 2] а-глюкозидазы не активны по отношению к полимерным а-глюканам, таким как амилоза и ами-лопектин. Существуют также а-глюкозидазы, ги-дролизующие а-1,6-связи изомальтозы и других разветвленных мальтоолигосахаридов, а-1,1-связи
Принятые сокращения: ЦД - циклодекстрин, РМ8Б - фе-нилметилсульфонилфторид, р№-С1 - паранитрофенил а-Б-глюкопиранозид, р№-С2 - паранитрофенил а-Б-маль-тозид, р№-С4 - паранитрофенил-а-Б-мальтотетразид, БТТ - дитиотреит.
* Эл. почта: velik@img.ras.ru; mashchenko@yandex.ru
трегалозы, а-1,2-связи сахарозы, а-1,3-связи ниге-розы и туранозы. Обнаружены а-глюкозидазы, специфичные по отношению к фосфорилирован-ным дисахаридным субстратам - трегалозо-6-фос-фату или мальтозо-6-фосфату. Нередко а-глюко-зидазы обладают широкой субстратной специфичностью и способны гидролизовать сразу несколько типов а-глюкопиранозидных связей. Более того, некоторые а-глюкозидазы обладают эндоамилазной активностью, расщепляя циклические мальтоолигосахариды - циклодекстрины (ЦД). ЦД - это группа нередуцирующих олигосаха-ридов, которые образуются из крахмала в результате действия циклодекстрин глюканотрансфераз [3]. Наиболее типичные ЦД, которые принято обозначать как а-, в- и у-ЦД, состоят соответственно из 6, 7 и 8 глюкопиранозных единиц, замкнутых в кольцо с образованием а-(1 —«- 4)-связей. Циклодекст-риназы ([К.Ф. 3.2.1.54], дециклизующие цикло-мальтодекстрингидролазы) - это ферменты, гид-
ролизующие ЦД лучше, чем крахмал [4, 5]. Большинство этих ферментов являются цитоплаз-матическими, максимально активны при температурах, не превышающих 50°С, их молекулярные массы лежат в пределах 62-90 кДа, что несколько больше, чем у большинства а-амилаз [6]. Аминокислотные последовательности типичных цикломальтодекстриназ, мальтогенных амилаз, а-амилазы II из Thermoactinomyces vulgaris и нео-пуллуланаз имеют 40-60% сходства [6]. Эти три типа ферментов объединены в группу ЦД-гидро-лизующих ферментов. Для нее характерно наличие 130 N-концевых амнокислотных остатков, участвующих в образовании димера, и наличие трансгликозилирующей активности, приводящей к образованию а-1,3-, а-1,4- или а-1,6-гликозид-ных связей [6].
Цель настоящей работы - изучение экспресии генов Thermotoga neapolitana, входящих в кластер генов, ответственных за транспорт и гидролиз мальтодекстринов. Задачей работы являлось субклонирование генов aglA и aglB из этого кластера, а также очистка и сравнительная характеристика кодируемых ими ферментов.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Бактериальные штаммы и плазмиды. Для работы использовали банк клонов T. neapolitana Z2706-MC24 в клетках штамма E. coli XL1-Blue ("Stratagene"), сконструированный, как описано ранее [7]. Для экспрессии генов использовали штамм E. coli M15 (pRep4) и плазмидный вектор pQE32 ("Qiagen", Германия). Клетки E. coli выращивали на среде LB [8] с добавлением ампициллина (100 мкг/мл), канамицина (25 мкг/мл) или окси-тетрациклина (12 мкг/мл). Для получения клеточных экстрактов рекомбинантные клетки E. coli выращивали на среде 2 х LB, содержащей ампициллин, после чего осаждали центрифугированием, промывали 50 мМ буфером Трис-HCl (pH 8.0) и ресуспендировали в 5 мл того же буфера с добавлением 2 мМ PMSF. Суспензию охлаждали во льду, обрабатывали ультразвуком до полного разрушения клеток, прогревали при 70°С в течение 30 мин и центрифугировали при 4°С. Супер-натант использовали для определения энзимати-ческой активности.
Методы работы с ДНК. Выделение плазмид-ной ДНК из клеток E. coli, обработку эндонукле-азами рестрикции, лигирование, электрофорез в агарозном геле, трансформацию, гибридизацию по Саузерну и другие стандартные процедуры выполняли согласно общепринятым методикам [8, 9].
Определение ферментативной активности и аналитические методы исследования. Для отбора клонов, обладающих термостабильной активностью на мальтоолигосахаридах, колонии выращи-
вали на чашках с 1.5%-ным LB-агаром при 37°С в течение ночи, прогревали 1 ч при 70°С и заливали 0.7% LB-агаром, содержащим 0.1% 4-О-метилум-беллиферил-а-Б-мальтозид. Активность определяли после инкубации чашек в течение 15 мин при 70°С по флуоресценции колоний под ультрафиолетом.
а-Глюкозидазную активность определяли в реакционной смеси (300 мкл), содержащей фермент, 2 мМ субстрат (pNP-а-глюкозид, pNP-а-мальтозид, pNP-а-пентозид или pNP-а-гептозид), 50 мМ буфер Трис-HCl (pH 7.5). При использовании AglA добавляли кофакторы - 1 мМ MnCl2, 2 мМ NAD+, 50 мМ DTT. Смесь инкубировали в течение 1-10 мин при 75°С, реакцию останавливали, добавляя 1M Na2CO3 (AglB) или EDTA до концентрации 0.5 мМ (AglA) и охлаждая в ледяной бане. Оптическую плотность измеряли при 420 нм. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое освобождает 1 мкМ ий^а-нитрофенола в минуту в данных условиях.
Циклодекстриназную активность определяли в реакционной смеси (30 мкл), содержащей фермент, 2 мМ ЦД ("Sigma") и 50 мМ буфер Трис-HCl (pH 7.5). Реакционную смесь инкубировали при 85°С в течение 30 мин. Концентрацию редуцирующих сахаров до и после инкубации измеряли с помощью динитросалицилового реагента [10]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое освобождает 1 мкМ редуцирующих сахаров в минуту при данных условиях. В качестве стандарта использовали глюкозу. Каждое измерение ферментативной активности повторяли, как минимум, три раза. Погрешность измерений составляла не более 5%. Продукты гидролиза анализировали при помощи тонкослойной хроматографии, как описано ранее [7]. Концентрацию белка измеряли по методу Брэдфорд [11]. Молекулярную массу белка определяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле (ПаАГ) по Лэмм-ли [12]. Молекулярную массу нативного белка определяли методом гель-фильтрации на колонке (1.3 х 95 см), содержащей сефарозу 4B-CL ("Pharmacia") и уравновешанной 50 мМ буфером Трис-HCl (pH 7.5) и 100 мМ NaCl. В качестве стандартов молекулярной массы использовали тиреогло-булин (669 кДа), апоферритин (443 кДа), ß-амила-зу картофеля (200 кДа) и бычий сывороточный альбумин (67 кДа) ("Sigma").
Очистка рекомбинантных ферментов AglA и
AglB. Клетки рекомбинантных штаммов E. coli M15/pQE-aglA и M15/pQE-aglB выращивали в среде 2 х LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Для индукции экспресии в экспоненциальной фазе роста (OD600 нм = 0.6) в культуру добавляли изопропилтиогалактозид, после
чего клетки инкубировали еще 3 ч, осаждали центрифугированием, промывали буфером (50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0.5% тритон X100, 0.1 мМ EDTA) и ресуспендировали в том же буфере с добавлением 2 мМ PMSF. Суспензию охлаждали во льду, обрабатывали ультразвуком до полного разрушения клеток, прогревали при 70°С в течение 30 мин и центрифугировали при 4°С. Супер-натант наносили на хроматографическую колонку (1.5 х 8.0 см), содержащую DEAE-Toyopearl 650 ("Toyo Soda", Япония), и элюировали, используя линейный градиент NaCl (0-0.5 М) в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0. Фракции, содержащие термостабильную а-глюкозидазную активность, диализовали против 50 мМ буфера Трис-HCl (pH 7.0), белок концентрировали ультрафильтрацией.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Характеристика рекомбинантного AglB
Для экспресии гена aglB РумП-А,го11-фрагмент ДНК длиной 1.58 т.п.н. из плазмиды pTnm2 (см. рис. 1 из [13]) субклонировали
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.