МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 801-809
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 575.852:577.124.2:579.864
КЛАСТЕР ГЕНОВ Thermotoga neapolitana, УЧАСТВУЮЩИХ В ДЕГРАДАЦИИ КРАХМАЛА И МАЛЬТОДЕКСТРИНОВ: МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА ЛОКУСА
© 2003 г. О. В. Березина, Н. А. Лунина, В. В. Зверлов, Д. Г. Наумов1, В. Либель2,
Г. А. Великодворская*
Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва, 123182 Федеральное государственное унитарное предприятие "ГосНИИгенетика", Москва, 113545 2Институт микробиологии и генетики, Университет Георга-Августа, Геттинген, D-37077, Германия
Поступила в редакцию 26.02.2003 г.
Клонирован и секвенирован фрагмент генома гипертермофильной анаэробной эубактерии Thermotoga neapolitana длиной 5451 п.н. Он содержит одну неполную и три полные открытые рамки считывания, высокогомологичные генам кластера утилизации крахмала и мальтодекстринов Thermotoga maritima, геном которой определен. Неполный продукт первой из них высокогомологичен MalG -белку транспорта мальтозы и мальтодекстринов из E. coli. Продукт второй - AglB - высоко гомологичен цикломальтодекстриназе с а-глюкозидазной активностью - TMG, принадлежащей к семейству 13 гликозилгидролаз (GH13); продукт третьей - AglA - гомологичен кофактор-зависимой а-глюкозидазе Thermotoga maritima из семейства GH4. Оба фермента образуют на филогенетическом древе семейства отдельную ветвь. Белки AglA и AglB дополняют друг друга по субстратной специфичности и могут обеспечить полный гидролиз до глюкозы циклических и линейных мальтодекстринов - промежуточных продуктов в процессе деградации крахмала. Продукт четвертой открытой рамки считывания высокогомологичен рибофлавин-специфической дезаминазе RibD из T. maritima. В гомологичном локусе этой бактерии между генами aglA и ribD имеется пять открытых рамок считывания, которых нет у T. neapolitana. Нуклеотидные последовательности двух из них гомологичны генам транспозаз. Размер делеции составляет 2.9 т.п.н.
Ключевые слова: Thermotoga neapolitana, геном, гипертермофилы, цикломальтодекстриназа, а-глюкозидаза, AglB, AglA.
Гипертермофильными считаются микроорганизмы, оптимальная температура роста которых равна 80°C или выше. Все гипертермофилы относятся исключительно к эубактериям или архебак-териям. Особое место занимают термофильные анаэробные эубактерии Thermotogales - одна из древнейших эволюционных ветвей на филогенетическом древе бактерий. По данным определения нуклеотидной последовательности генома Thermotoga maritima 24% генов этой бактерии гомологичны генам архебактерий (81 ген из 15 ло-кусов генома T. maritima). Это позволило предположить, что существует латеральный перенос генов между термофильными эубактериями и архебактериями [1]. Гены Thermotoga можно рассматривать в качестве кандидатов для исследования эволюционных аспектов путей метаболизма гипертермофильных микроорганизмов, а также для изучения ферментативных семейств.
Принятые сокращения: а.о. - аминокислотный остаток.
* Эл. почта: velik@img.ras.ru; mashchenko@yandex.ru
Грамотрицательные эубактерии рода ТНвтшо-toga являются анаэробными сахаролитическими гетеротрофами и используют для роста углеводные субстраты, в частности крахмал и мальтодек-стрины [2]. Мальтодекстрины - это олигосахари-ды, состоящие из остатков глюкозы, соединенных между собой а-глюкопиранозидными связями. В отличие от крахмала, используемого главным образом для обеспечения запасов энергии, мальтодекстрины обычно находятся в свободном состоянии в цитоплазме и служат важнейшими промежуточными продуктами в химических реакциях, преобразующих извлеченную из крахмала энергию в пригодную для использования форму. Гидролиз разнообразных, поступающих в клетку, мальтодекстринов осуществляется внутриклеточными ферментами а-глюкозидазами.
Целью настоящей работы стало изучение ло-куса геномной ДНК Theтmotoga пвароШапа, содержащего кластер генов, ответственных за транспорт и гидролиз мальтодекстринов.
T. maritima MSB8
amyA malE malF
(tm1840)(tm1839) (tm1837)
malG
(tm1836) 0 1
aglB (tm1835) 2
aglA (tm1834) 3 4
ribD
(tm1828) 5
T. neapolitana Z2706-VC24
PvuII 1404
AsuII Kpnl AsuII 2985 3933 4542
ribD
malG aglB aglA
pTnm1 pTnm2
aglB
aglA
Рис. 1. Схема фрагмента ДНК T. neapolitana Z2706-MC24 (EMBL AJ009832) длиной 5451 п.н., клонированного в составе плазмид pTnml и pTnm2, и гомологичного участка ДНК T. maritima MSB8 [1]. Рассматриваемые участки ДНК содержат гены кластера утилизации крахмала и мальтодекстринов. Стрелками показано направление транскрипции генов.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использован банк клонов T. neapolitana Z2706-MC24, сконструированный, как описано ранее [3], на основе pUC 18 в клетках штамма E. coli XL1-Blue (Stratagene). Клетки E. coli выращивали на среде LB [4] с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и окситетрациклина (12 мкг/мл).
Определение ферментативной активности на чашках. Для отбора клонов, обладающих термостабильной активностью переваривания мальто-олигосахаридов, колонии выращивали на чашках с 1.5%-ным LB-агаром при 37°С в течение ночи, прогревали 1 ч при 70°С и заливали 0.7%-ным LB-агаром, содержащим 0.1% 4-О-метилумбелли-ферил-а-Б-мальтозид. Активность определяли после инкубации чашек в течение 15 мин при 70°С по флуоресценции колоний под ультрафиолетом.
Плазмидную ДНК выделяли из клеток E. coli, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции, лиги-ровали, очищали путем электрофореза в агароз-ном геле, далее проводили трансформацию, гибридизацию по Саузерну и другие стандартные процедуры согласно общепринятым методикам [4, 5]. Выделение хромосомной ДНК из клеток штамма T. neapolitana Z2706-MC24 и определение нуклеотидной последовательности обеих цепей плазмидной ДНК проводили как описано ранее [3]. Данные анализировали и обрабатывали с помощью пакетов программ DNASIS (Hitachi Software Engineering), NCBI BLAST (http:www.nc-bi.nlm.nih.gov), CLUSTAL (EBI-server at EMBL, Hinxton, UK).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Два рекомбинантных клона, проявляющих активность на 4-метилумбеллиферилл-а-Б-мальто-зиде, были отобраны из геномной клонотеки T. neapolitana в E. coli, сконструированной ранее [3]. Клоны содержали рекомбинантные плазмиды pTnml и pTnm2 с перекрывающимися вставками хромосомной ДНК длиной 8.1 и 5.2 т.п.н. соответственно. Размер общего для обеих плазмид фрагмента ДНК T. neapolitana составил 3.8 т.п.н. (рис. 1). Отсутствие внутренних перестроек во вставках показано путем гибридизации по Саузерну хромосомной ДНК T. neapolitana, обработанной различными рестриктазами, с меченой плазмидной ДНК (данные не представлены). Как видно из рис. 1, нуклеотидная последовательность фрагмента генома T. neapolitana, клонированного в составе плазмид pTnml и pTnm2, имеет длину 5451 п.н. (AJ009832, EMBL Data-Bank) и включает одну неполную (ORF1) и три полных (ORF2-ORF4) открытых рамки считывания (табл. 1). ORF1 гомологична гену malG из E. coli, кодирующему белок транспорта мальтозы и мальтодекстринов [6].
Последовательность ORF2 высокогомологична последовательности гена TM1835 из T. maritima, кодирующего циклодекстриназу TMG [1, 7]. ORF2 кодирует AglB (наше первоначальное название этого гена в EMBL Data-Bank - malA). Два потенциальных стартовых кодона aglB перекрываются с терминирующим кодоном TGA открытой рамки считывания впереди лежащего гена malG (ATGATG). В зависимости от того, какой стартовый кодон используется, полипептид AglB может состоять из 472 или 473 а. о. Нуклеотидная последовательность T. neapolitana содержит еще один потенциальный стартовый кодон для гена aglB, расположенный перед двумя другими в той
Таблица 1. Характеристика фрагмента ДНК T. neapolitana, содержащего открытые рамки считывания генов malG, aglB, aglA и ribD. В скобках указаны порядковые номера первого нуклеотида сайта в последовательности T. neapolitana (AJ009832 EMBL-Data Bank)
Ген malG (неполный) aglB aglA ribD
Длина белка, а. о. >498 472 (473) 481 241
Стартовый кодон - ATGATG (1496) ATG (3050) ATG (4729)
Стоп-кодон TGA (1497) TGA (2915) TAA (4490) TGA (5448)
Сайт связывания с рибосомой - GAAAGG (1490) GGAGG (3038) GGGGTG (4718)
Гомологичные гены из T. maritima malG (AE001820 EMBL-Data Bank) aglB (AE001820 EMBL-Data Bank) aglA (AE001820 EMBL-Data Bank) ribD (AE001819 EMBL-Data Bank)
и кодируемые ими белки белок транспорта мальтоолигосахаридов цикломальтодекстри-наза (а-глюкозидаза B), семейство GH13 а-глюкозидаза A, (семейство GH4) рибофлавин-специфическая дезаминаза
% сходства аминокис- 78% 90% 90% 71%
лотных последовательностей T. neapolitana и T. maritima
же рамке считывания, но отстоящий от них на 111 нуклеотидов. Однако вряд ли этот кодон используется in vivo. Во-первых, в этом случае часть гена aglB будет перекрываться с открытой рамкой считывания гена malG. Во-вторых, аминокислотная последовательность, выведенная на основе этого участка ДНК, не имеет существенного сходства с N-концевой последовательностью ферментов, гомологичных AglB. В третьих, в гомологичном локусе генома T. maritima этот стартовый кодон отсутствует.
ORF3 высокогомологична гену aglA из T. maritima. Выведенная на основе гена аминокислотная последовательность состоит из 481 а.о. с вычисленной молекулярной массой 54.03 кДа и имеет высокую степень гомологии с NAD+-, Mn2+- и ти-ол-зависимой а-глюкозидазой AglA из T. maritima [8, 9]. Потенциальная рибосомосвязывающая последовательность (5'-GGAGG-3') комплементарна 3'-концу 16S РНК E. coli (5'-CCACCUCCUUUCU-3') и T. maritima (5'-UCACCUCCUUA-3').
ORF4 кодирует белок, предположительно гомологичный предполагаемой рибофлавин-специфической дезаминазе RibD из T. maritima (табл. 1).
Гены malG, aglB и aglA расположены на хромосоме T. neapolitana Z2706-MC24 один за другим (рис. 1). Порядок и ориентация генов malG, aglB и aglA у T. neapolitana и у T. maritima сходны. В геноме T. maritima MSB8 перед генами TM1836 (malG), TM1835 (aglB) и TM1834 (aglA) в той же ориентации расположены гены malF, malE, и, в противоположной ориентации, amyA. Здесь MalF -внутримембранный белок сис
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.