Объединенный иммунологический форум, Нижний Новгород 2013
КЛЕТКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ: развитие, активация, апоптоз и эффекторные функции
Возрастные изменения уровня ТЫР-а и готовности к Рээ-индуцированному апоптозу Т-лимфоцитов периферической крови
Антонеева И. И., Абакумова Т. В., Генинг Т. П., Генинг С. О.
Ульяновский государственный университет, Ульяновск, Россия
Показано, что практически каждый компонент иммунной системы претерпевает значительные возрастные перестройки, ведущие к изменению уровня их функционирования ^оЬегсоп А., ЕАгте Р. В., 2000]. С целью изучения возрастных изменений готовности к Рэ$-индуцированному апоптозу и влияния на нее уровня индуктора апоптоза Т№-а в лимфоцитах периферической крови женщин в репродуктивном периоде и в постменопаузе методом проточной цитоф-луориметрии определяли экспрессию на поверхности клеток Рэ$-рецептора Р95-антигена), оценивали апоптоз по уровню фрагментации ДНК, а также уровень Т№-а в плазме крови методом ИФА. При оценке статистической значимости полученных результатов использовали ^критерий Стьюдента. Установлено, что в постменопаузе на фоне увеличения лейкоцитов периферической крови происходит значимое снижение относительного количества лимфоцитов (Лф) (37,1+0,4 % против 39,7±0,2 %) при существенном повышении на них экспрессии CD95 (68,7±0,9 % против 59,4±1,0 % в репродуктивном периоде). Процесс упорядоченной фрагментации ДНК начинался раньше и уровень фрагменти-рованной ДНК был выше в Лф женщин в постменопаузе (12,6±0,7 % против 6,1±0,9 % в репродуктивном периоде при «чистой» инкубации). Уровень Т№-а в плазме крови женщин в постменопаузе был значимо выше (32,5±0,7 нг/мл против 28,6±0,4 нг/мл в репродуктивном периоде). Полученные результаты позволяют предполагать возрастное повышение готовности к РаБ-индуцированному апоптозу Лф на фоне увеличения уровня ФНО-а.
Работа выполнена при поддержке гос. задания Минобрнауки России
Динамика изменений фенотипа дермальных фибробластов человека на этапах культивирования
Алейник Д. Я., Чарыкова И. Н., Сидорова Т. И., Рубцова Ю. П. Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Минздрава России, Нижний Новгород, Россия
Одним из направлений современной медицинской науки является развитие клеточных технологий и внедрение их в клиническую практику. Существенное значение при клиническом применении клеточных культур имеет их качество, одной из важнейших характеристик которого является фенотип клеток. Задача настоящей работы - изучить динамику изменения фенотипа дермальных фибробластов человека на этапах культивирования. Материалы и методы. Работа проведена на 10 культурах дермальных фибро-бластов, которые были выделены из биоптатов кожи человека, полученных при косметических операциях. Использовались только материал, полученный
у пациентов, каждый из которых дал информированное добровольное согласие на применение материала в научных исследованиях. Культивирование проводили в условиях СО2 инкубатора при 37 °С, 5 % СО2, абсолютной влажности. В качестве ростовой среды использовали среду ДМЕМ с добавлением антибиотиков (пенициллин/стрептомицин), глутамина, 10 % телячьей эмбриональной сыворотки. Исследование проводили на клетках на этапах культивирования от 0 до 7 пассажа. Контроль за ростом культуры осуществляли с помощью инвертированного микроскопа"1_е1са'; оснащенного видеокамерой и компьютерной программой видеоархивирования. Жизнеспособность клеток в культуре определяли с помощью прижизненной окраски трипановым синим. Фенотип клеток определяли на цитофлюриметре фирмы ВескшапСоиКег с использованием наборов реагентов той же фирмы. Результаты. Все культуры дермальных фибробластов характеризовались едиными морфологическими особенностями и представляли собой монослойные культуры, сформированные клетками преимущественно веретеновидной реже звездчатой формы с плотными ядрами и выраженными отростками. Культуры характеризовались хорошей жизнеспособностью и высоким пролиферативным потенциалом. Начиная с первого пассажа, культуры были практически гомогенными и характеризовались фенотипом типичным для клеток мезенхимального ряда CD90+/CD105+/CD44+/CD116+/CD10+/CD34-/CD45-. При этом высокий процент клеток с фенотипом CD90+/CD105+/CD44+ фиксировался на протяжении всего периода исследования, а процент клеток с маркерами CD116+/CD10+ был значительно ниже и был подвержен значительным колебаниям. Клетки гемопоэтического ряда с маркерами CD34+/CD45+ фиксировались только в первичной культуре в незначительном количестве, а начиная с 1 пассажа - отсутствовали.
Иммуноферментное определение содержания дефенсинов нейтрофильных гранулоцитов в плазме крови крыс в условиях экспериментального стресса
Алешина Г. М., Янкелевич И. А.
Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия
Одним из недостаточно разработанных положений современной концепции взаимодействия нервной и иммунной систем остается вопрос о роли биологически активных веществ нейтрофильных гранулоцитов в регуляции защитных функций организма. Представление о нейтрофилах исключительно как клеточных факторах антимикробной резистентности не отражает всех данных об их функциональных возможностях. Так, ранее на моделях экспериментального стресса было продемонстрировано свойство экзогенных дефенсинов нейтрофилов влиять на некоторые показатели эндокринного и иммунного статуса организма экспериментальных животных в условиях стрессирующего воздействия, в частности снижать уровень кортикостерона в крови. Целью настоящей работы является оценка содержания эндогенных дефен-синов в плазме крови крыс в динамике экспериментального стресса.
В качестве экспериментальной модели стресса использовали плавание в холодной воде (1°-4 °C) в течение 2 минут. Забор крови осуществляли через 30 минут и 3 часа после стрессирующего воздействия. Определяли количество лейкоцитов и формулу крови. В плазме крови определяли содержание дефен-синов с помощью иммуноферментного анализа «сэндвич-методом». Так как в настоящее время не существует коммерческих наборов для определения концентрации этих пептидов, нами были выделены в чистом виде дефенсины нейтрофилов крыс (RtNP1-4), получены антитела к дефенсину RtNP3, которые были использованы в качестве первичных антител в иммуно-ферментной тест-системе и для получения конъюгата антител с пероксидазой хрена. Полученная тест-система имеет чувствительность 0,1 нг/мл и диапазон измерения 0,1 нг/мл - 8 нг/мл. Показано, что тест-система на основе антител к RtNP3 выявляет также дефенсин RtNP2 (с эффективностью 3 %), но не дефенсины RtNPI и RtNP4.
Впервые установлено, что у интактных крыс содержание дефенсина RtNP-3 в плазме крови составляет 42±12 нг/мл. Через 30 минут после стрессирующего воздействия концентрация дефенсина составила 87±29 нг/мл, а через 3 часа - 246±98 нг/мл, что достоверно отличается от таковой у интактных животных. Так как в ходе развития стресс-реакции на смену нейтропении (через 30 минут после стресса) приходит нейтрофилез (через 3 часа), рассчитывали относительное содержание дефенсина в плазме крови крыс (на 1 млн. нейтрофилов). Относительное содержание дефен-сина в плазме крови достоверно увеличивается после стресса. Через 30 минут после воздействия оно составило 43±10 нг/млн. нейтрофилов, через 3 часа - 36±8 нг/млн. нейтрофилов, тогда как для интактных животных оно составляет 11±4 нг/млн. нейтрофилов. Полученные данные говорят об усилении секреции дефенсинов из нейтрофилов в условиях стресса, что может свидетельствовать о вовлеченности этих пептидов в ход развертывания стресс-реакции.
Работа подержана грантами РФФИ № 12-04-01498 и № 12-04-01573.
Активность апоптоза нейтрофилов периферической крови
Балашова С. Н., Ставинская О. А., Леванюк А. И. Институт физиологии природных адаптаций УрО РАН, Архангельск, Россия
Нейтрофильные гранулоциты периферической крови являются уникальными клетками иммунной системы. Они способны к синтезу всех известных цитоки-нов, вазомоторных аминов и каталитических ферментов (Нестерова И. В., 2010; Gullberg U., 1997). Регуляция функциональной активности и продолжительности жизни нейтрофилов осуществляется за счет механизма апоптоза, что обеспечивает безопасное удаление стареющих, инфицированных или генетически измененных гранулоцитов. В естественных условиях апоптоз нейтрофилов предотвращает воспалительные реакции, которые могут быть вызваны бесконтрольным выбросом в окружающую среду внутреннего содержимого клетки. В литературе имеются единичные сведения об уровне апоптоза нейтрофилов, а решение данной проблемы находится в стадии накопления фактов. Целью работы явилось определение уровня апоптоза нейтрофилов в зависимости от их пролиферации, активности фагоцитоза и цитокинового профиля периферической крови.
Материалы и методы. Обследованы 49 клинически здоровых добровольцев с соблюдением норм биомедицинской этики. Апоптоз и некроз нейтрофи-лов оценивали методом проточной лазерной цитофлуориметрии на приборе «Epics XL» («Beckman Coulter», США). Исследование иммунного статуса включало определение уровня иммунокомпетентных клеток; показателей фагоцитоза; цитокинов (IL-4, IL-6, IFN-y, TNF-a, IL-17F) и лиганда sTRAIL в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа («Bender MedSystems», Австрия). Результаты исследования. У клинически здоровых людей в периферической венозной крови активность апоптоза нейтрофилов в среднем составляет 6,09±0,36 %, и колеблется в пределах 1о от 3,31 до 8,87 %. Уровень некроза в 2 раза ниже 3,58±0,24 %, в пределах 1о от 1,57 до 5,59 %, что способствует поддержанию клеточного гомеостаза без воспалительной реакции.
С целью определения особенностей взаимосвязи апоптоза нейтрофилов с иммунологическими показателями крови из общего количества обследованных людей была выделена группа лиц с относительно низким (< 3 %; N=18) и повышенным (> 8 %; N=15) содержанием апоптоти-ческих нейтрофилов. Установлено, что активизация апоптоза грануло-цитов ассоциирована с повышением содержания их палочкоядерных форм (с 0,13±0,04 до 0,24±0,07х109 кл/л
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.