научная статья по теме КЛЕТОЧНАЯ АГРЕГАЦИЯ ПОВЫШАЕТ ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ КЛЕТОК ОСТРОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА Биология

Текст научной статьи на тему «КЛЕТОЧНАЯ АГРЕГАЦИЯ ПОВЫШАЕТ ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ КЛЕТОК ОСТРОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА»

УДК 616-006.4;576.52

КЛЕТОЧНАЯ АГРЕГАЦИЯ ПОВЫШАЕТ ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ КЛЕТОК ОСТРОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА

© 2015 г. Р. С. Фадеев1*, М. Е. Соловьева1, Д. А. Слядовский3, С. Г. Захаров4, И. С. Фадеева1,2, А. С. Сенотов5, Н. В. Долгих1,2, А. К. Голенков4, В. С. Акатов1,2

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская область;

*электронная почта:fadeevrs@gmail.com 2Пущинский государственный естественно-научный институт МОН, 142290, Пущино, Московская область 3Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 603950, Нижний Новгород 4Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского (МОНИКИ), 129110, Москва 5Саратовский медицинский центр ФМБА России, 413840, Балаково, Саратовская область

Поступила в редакцию 15.11.2014 г.

Одной из основных причин недостаточной эффективности терапии острого миелоидного лейкоза считается приобретение устойчивости лейкозными клетками к действию цитотоксических препаратов. Важную роль в формировании фенотипа лекарственной устойчивости лейкозных клеток играют факторы микроокружения, поэтому для выявления новых фармакологических мишеней консервативной терапии направленного действия необходимо понимать механизмы лекарственной устойчивости, опосредованной условиями микроокружения. Нами изучена роль агрегации клеток в формировании лекарственной устойчивости лейкозных клеток. Показано повышение устойчивости клеток острого миелоидного лейкоза человека ТНР-1 к действию бортезомиба, доксорубицина и флу-дарабина в многоклеточных агрегатах. Повышение устойчивости клеток ТНР-1 в многоклеточных агрегатах происходит на фоне сохранения их пролиферативной активности и повышения внутриклеточного уровня антиапоптотического белка Вс1-2. Подавление межклеточной адгезии клеток ТНР-1 препятствует возникновению лекарственной устойчивости. В работе показана роль агрегации клеток острого миелоидного лейкоза в приобретении фенотипа лекарственной устойчивости.

Ключевые слова: острый миелоидный лейкоз, лекарственная устойчивость, межклеточная адгезия, многоклеточные агрегаты.

Б01: 10.7868/80233475515020061

ВВЕДЕНИЕ

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) — злокачественная опухоль миелоидного ростка гемопоэ-тической системы. Для ОМЛ характерна быстрая клональная экспансия и накопление в костном мозге трансформированных клеток с различной степенью зрелости с последующим выходом в кровеносное русло. При накоплении трансформированных клеток-предшественников и более зрелых бластных форм в костном мозге происходит подавление нормального гемопоэза [1]. Эффективность терапии ОМЛ колеблется от 20 до 45% [2]. Одну из основных причин недостаточной эффективности терапии ОМЛ связывают с возникновением лекарственной устойчивости лейкозных клеток. Этиология данного феномена представлена, как минимум, двумя основными причинами. Одна из них — приобретение устойчивости к препаратам, которая возникает при длительном

их применении в результате активации или повышения экспрессии белков-транспортеров системы множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), таких как Р-гликопротеид, МЯР1-5, ВСЯР [3]. Другая, не менее важная причина — микроокружение лейкозных клеток в костном мозге. Такие элементы стромы костного мозга, как мезенхимальные стромальные клетки и внеклеточный матрикс, способствуют повышению устойчивости лейкозных клеток к цитотоксиче-ским воздействиям [4]. Клетки, зависимые от адгезии к внеклеточному матриксу (саркомы, карциномы, глиомы, нейробластомы и т.д.), обладают еще одним механизмом повышения лекарственной устойчивости — так называемой многоклеточной устойчивостью, возникающей при формировании трехмерных сфероидов, состоящих из клеток одного типа. Возникновение такого вида устойчивости связывают как с формированием

межклеточных контактов, так и с адгезией клеток к внеклеточному матриксу, но механизмы этого явления остаются неизученными [5]. При этом неизвестно, возможно ли формирование сходной формы устойчивости к цитотоксическим препаратам у лейкозных клеток, функционирование которых не зависит от адгезии к внеклеточному матриксу.

В представленной работе изучена возможность повышения лекарственной устойчивости клеток ОМЛ в условиях, способствующих межклеточной адгезии, при формировании трехмерных многоклеточных агрегатов, состоящих из клеток одного типа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вещества. В качестве цитотоксических веществ использовали фосфат флударабина (8^та-АЫпсИ, США), гидрохлорид доксорубицина (8^та-АЫпсИ, США) и бортезомиб (РБ-341) (8е11есксИет, США).

Клеточные культуры. В работе использовали клетки линии ТНР-1 и КО-1 ОМЛ человека, полученные из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки культивировали в среде ЯРМ1-1640/ F-12 (81§та-АЫг1сИ, США) с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки ^&со, США) — полная ростовая среда, 40 мкг/мл сульфата гентамицина (81§та-АЫг1сИ, США), при 37°С, в условиях С02-инкубатора (5% СО2 в воздухе). При культивировании клетки линии ТНР-1 спонтанно формировали агрегаты, состоящие из 10—50 клеток. Клетки линии KG-1 агрегаты не формировали и были представлены суспензией одиночных клеток. Клетки культивировали на 96-луночных планшетах в количестве 5 х 103 клеток в лунке в 100 мкл питательной среды ЯРМ1-1640/Р-12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 24 ч, затем добавляли цитотоксические агенты, культивировали дополнительно 72 ч и анализировали выживаемость клеток.

Формирование многоклеточных агрегатов. Для

формирования многоклеточных агрегатов 96-лу-ночные планшеты покрывали 1.5% раствором агарозы (Рапгеас, Испания). Затем высевали по 5 х 103 клеток в лунку в 100 мкл полной ростовой среды. Через 24 ч в каждой лунке формировался единичный агрегат клеток.

Культивирование клеток в полужидкой среде. С

целью выяснения роли межклеточных контактов в формировании лекарственной устойчивости клетки культивировали в содержащей метилцел-люлозу среде, предотвращающей спонтанную агрегацию клеток. Клетки инкубировали в течение 24 ч в 96-луночных планшетах (по 5 х 103 клеток в

лунке) в 100 мкл полной ростовой среды, содержащей 0.9% метилцеллюлозы (Sigma-Aldrich, США). Через 24 ч в каждой лунке находилась суспензия одиночных клеток.

Анализ жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток после инкубации с цитотоксиче-скими агентами оценивали по интенсивности восстановления метаболического индикатора AlamarBlue (Invitrogen, США). Для этого к клеткам после 72 ч инкубации с цитотоксическими агентами добавляли AlamarBlue в концентрации 100 мкг/мл. Затем клетки инкубировали с красителем в течение 4 ч при 37°С и 5% содержания СО2 в воздухе, измеряли интенсивность флуоресценции при длине волны 595 нм с использованием планшетного спектрофлуориметра Infinity F 200 (Tecan, Австрия). Выживаемость клеток оценивали по отношению результатов, полученных в опытных и контрольных (без добавления цито-токсических препаратов) культурах, выраженному в процентах. Дополнительно цитотоксическое действие фосфата флударабина, гидрохлорида доксорубицина и бортезомиба оценивали с помощью окрашивания клеток трипановым синим.

Флуоресцентная микроскопия. Для определения митотической активности клетки после 24 ч инкубации в различных условиях центрифугировали (400 g, 10 мин), ресуспендировали в фосфат-но-солевом буфере, фиксировали 70% этиловым спиртом (40 мин, при комнатной температуре). Затем фиксированные клетки окрашивали флуоресцентным красителем bisBenzimide H 33342 (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 1 мкг/мл в течение 10 мин при комнатной температуре и подсчитывали число митотических клеток с помощью флуоресцентного микроскопа DM 6000 (Leica, Германия).

Проточная цитометрия. Клетки для изучения их распределения по количеству ДНК центрифугировали (400 g, 10 мин, комнатная температура), ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере, фиксировали 70% этиловым спиртом (40 мин, при комнатной температуре) и окрашивали в среде следующего состава (фосфатно-со-левой буфер, 1% эмбриональной телячьей сыворотки, 0.25 мг/мл РНКазы, 20 мкг/мл йодида пропидия) в течение 15 мин при 37°C.

Для изучения распределения клеток по количеству белка Bcl-2 клетки центрифугировали (400 g, 10 мин, при комнатной температуре), ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере, фиксировали 4% раствором параформальдегида (Appli-chem, США) в течение 60 мин при 4°C. Затем клетки трижды отмывали фосфатно-солевым буфером и ресуспендировали в пермеабилизующем растворе (фосфатно-солевой буфер, 1% эмбриональной телячьей сыворотки, 0.5% раствор сапонина) и инкубировали в течение 15 мин при ком-

Рис. 1. Микрофотографии клеток ТНР-1. а — Многоклеточный агрегат (условия способствующие агрегации, культивирование на 1.5% агарозе); б — спонтанные клеточные агрегаты (контрольные условия); в — одиночные клетки (условия, препятствующие агрегации, культивирование в среде с 0.9% метилцеллюлозы). Линейка 100 мкм.

натной температуре. Далее клетки окрашивали моноклональными антителами к Bcl-2, коньюги-рованными с изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ), и контрольными антителами изотипа (BD Bioscience, США), следуя инструкции производителя.

Внутриклеточное количество ДНК и уровень белка Bcl-2 определяли с помощью проточного цитометра EPICS XL (Beckman Coulter, США).

Статистический анализ. Результаты представляли в виде среднего ± стандартная ошибка (M ± SEM). Опыты проводили не менее чем в трех повторах (n > 3). Статистическую значимость отличий определяли с использованием критерия Уилкоксона—Манна.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Повышение устойчивости клеток ОМЛ человека THP-1 к действию цитотоксических препаратов в многоклеточных агрегатах. Клетки ОМЛ человека THP-1 способны спонтанно формировать клеточные агрегаты, состоящие из 10—50 клеток (контрольные условия, рис. 1б). При культивировании клеток THP-1 в условиях, способствующих агрегации (см. Материалы и методы), происходит формирование единичного многоклеточного агрегата, включающего большую часть клеток в лунке (рис. 1а). В условиях многоклеточного агрегата клетк

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»