БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 4, с. 301-307
УДК 57.085.23
КЛЕТОЧНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ К-КАНАЛ hERG, ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КАРДИОТОКСИЧНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ. ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ
© 2008 г. А. А. Шутов, О. В. Лебедева, Р. А. Романов*, О. А. Рогачевская*, Н. В. Кабанова*, С. С. Колесников*, Э. Р. Сафарова
ООО "ЛАБОРАТОРИЯ БИОСКРИНИНГА", 125367 Москва, ул. Габричевского, 5, к. 8 * Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино, Московская область; электронная почта: cheglok@rambler.ru Поступила в редакцию 19.02.2008 г.
Кардиотоксичность многих лекарственных препаратов обусловлена блокированием К+-каналов типа hERG и, как следствие, пролонгированием фазы реполяризации потенциала действия сердечных клеток и возникновением аритмий. Одна из важных задач доклинических исследований - раннее выявление ингибирующих эффектов потенциальных лекарственных средств на активность К+-ка-налов, функционирующих в кардиомиоцитах. Цель представленной работы состояла в получении клеточной линии, стабильно и на достаточно высоком уровне экспрессирующей рекомбинантные hERG-каналы, что необходимо для использования этой линии клеток в качестве тест-системы.
В норме электрическая возбудимость сердечной мышцы определяется тонким балансом деполяризующих и реполяризующих ионных токов, переносимых различными ионными каналами, при участии систем Ca2+ гомеостаза и щелевых контактов [1, 2]. Аритмия - одна из самых распространенных патологий сердца, возникновение которой в значительной степени связано с функциональными нарушениями работы ионных каналов [1-3]. Врожденная аритмия строго коррелирует с полиморфизмом генов, кодирующих потенциал-зависимые (VG, voltage-gated) К+- и Ка+-каналы плазма-леммы, а также рианодиновые рецепторы и Ca2+-АТР-азу саркоплазматического ретикулума [1-5]. С точки зрения феноменологии аритмии определяющую роль в ее возникновении играет удлинение фазы реполяризации потенциала действия, генерируемого кардиомиоцитом. В клинической практике функциональные нарушения стадии реполяризации отчетливо проявляются на электрокардиограмме как удлинение интервала между Q и T волнами (синдром длинного Qt, long QT syndrome). Молекулярные механизмы врожденного LQT-син-дрома интенсивно изучали, и в настоящий момент установлено, что это явление возникает при генетических нарушениях, приводящих к замедлению инактивации VG Ca^-TO^B, уменьшению VG К+-токов определенного типа и/или к увеличению VG ^^токов по сравнению с нормой. Врожденный LQT-синдром ассоциируется с мутациями нескольких канальных белков, включая KCNQ1 и KCNE1 - а- и Р-субъединицы медленных К+-кана-лов задержанного выпрямления, соответственно, hERG (human ether-a-go-go gene) и KCNE2 - а- и Р-
субъединицы быстрого К+-канала задержанного выпрямления, KCNJ2 - а-субъединица К+-канала входного выпрямления, CACNA1C - а-субъединица Са2+-канала L-типа и SCN5A - VG №+-канал [2-5].
Явление, сходное с врожденным LQT-синдро-мом, можно наблюдать при блокаде VG К+-кана-лов, в результате которой удлиняется фаза реполяризации и повышается риск желудочковых аритмий [6, 7]. Особый интерес представляет К+-канал hERG-типа. Это связано с тем, что кардиотоксичность многих лекарственных средств (ЛС) обусловлена ингибированием активности этих К+-каналов и, как следствие, увеличением интервала QT и возникновением аритмий [7-10]. Характерный пример таких ЛС - антигистаминные препараты второго поколения - терфенадин и астемизол, избыточное накопление которых в крови приводит к кардио-токсическим эффектам [11, 12]. В ряде стран это послужило основанием для отказа в перерегистрации терфенадина и астемизола и изъятия их из аптечной сети. Удлинение интервала QT под действием фторхинолонов в целом рассматривается как групповое свойство этих ЛС [13, 14]. Их применение в клинической практике позволило выявить существование аритмогенной активности у фторхинолонов, которая может проявляться удлинением интервала QT на электрокардиограмме, возникновением двунаправленной веретенообразной желудочковой экстрасистолии (синдром пируэта - "torsade de pointes"), атриовентрикулярной блокады и блокады ножек пучка Гиса.
Таким образом, раннее выявление ингибирующих эффектов потенциального ЛС на активность
К+-каналов кардиомиоцитов является важной задачей доклинических исследований, поскольку позволяет исключить потенциально кардиотоксичные соединения. В мировой практике доклинического тестирования ЛС обычно используют линии клеток, экспрессирующие К+-каналы. Наиболее часто это линии СНО или НЕК-293, экспрессирующие ген hERG. Однако коммерчески доступных линий не так много ("Millipore", США; "Perkin Elmer", США), и они весьма дороги. Нашей задачей было получение собственной клеточной линии, стабильно трансфицированной кДНК гена hERG. Для того чтобы эта клеточная линия была адекватной тест-системой, необходимо, чтобы она стабильно экс-прессировала ген hERG на высоком уровне. Для решения поставленной задачи использовали два методически разных подхода: 1) стандартную трансфек-цию клеток НЕК-293 вектором pcDNA3.1 и 2) трансфекцию клеток СНО лентивирусным вектором pCDH1-MCS1-EF1-Puro. Сравнительный анализ этих подходов и полученных результатов составили предмет данной работы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культура клеток. Использовали клетки линий HEK-293 и CHO (ИНЦ РАН, Россия). Клетки культивировали в средах DMEM и F12 соответственно ("Gibco", США) с добавлением 10% эмбриональной бычей сыворотки (FBS) во влажной атмосфере с 5% С02, при 37°С.
Молекулярное клонирование. кДНК hERG ("OriGene Technologies", США) субклонировали в вектор pcDNA3.1 по EcoRI- и NotI-сайтам ("Invitro-gen", США). Таким образом получили конструкцию pcDNA3/hERG. По тем же сайтам кДНК hERG субклонировали в лентивектор pCDH1-MCS1-EF1-Puro ("System Biosciences (SBI)", США). Полученную лентивирусную экспрессионную конструкцию назвали pCDH1/hERG. Оба вектора содержат цитомегаловирусный (CMV) промотор, который определяет экспрессию кДНК вставки (HERG). Вектор pcDNA3.1 несет ген устойчивости к G-418, а лентивектор - ген устойчивости к пуромицину.
Трансфекция. Клетки HEK-293 трансфициро-вали вектором pcDNA3/hERG с использованием Li-pofectamine 2000 ("Invitrogen", США) в соответствии с протоколом производителя. Через 48 ч после трансфекции к клеткам добавляли G-418 в конечной концентрации 800 мкг/мл. После полной гибели всех клеток, не имеющих устойчивости к G-418, концентрацию антибиотика снизили до 400 мкг/мл, и в дальнейшем культивировали клетки при этой концентрации. Живые клетки рассевали в 96-лу-ночную плашку из расчета одна клетка на лунку. Колонии, образованные отдельными клетками, далее культивировали как отдельные клоны.
pCDH1/hERG упаковывали в псевдовирусные частицы в клетках HEK-293 при помощи pPACKH Lentivector Packaging Kit ("System Biosciences (SBI)", США). Клетки HEK-293 высевали накануне трансфекции (по 4 млн клеток на 10 см чашку Петри). Смешивали 5 мкг pPACK упаковочной плазмиды, 1 мкг pCDH1/hERG и 400 мкл DMEM (без добавления FBS), и смесь инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 15 мкл Lipofectamine 2000 и использовали смесь для обработки клеток HEK-293 в среде DMEM + + 2% FBS. После инкубации в течение ночи среду заменяли на свежую того же состава. Через 48 ч после трансфекции от клеток HEK-293 отбирали среду, содержащую псевдовирусные частицы.
Клетки CHO высевали на 24-луночную плашку (1 х 105 клеток на лунку) и инкубировали при 37°С в течение 24 ч в среде F12 (10% FBS). В каждую лунку добавляли 0.5 мл среды с псевдовирусными частицами и Polybrene ("Sigma", США) до конечной концентрации 5 мкг/мл. Через 24 ч среду заменяли на новую. Через 72 ч после инфицирования в среду добавляли пуромицин в конечной концентрации 10 мкг/мл, после чего клетки культивировали при данной концентрации пуромицина. Клоны получали так же, как описано выше.
Проверка экспрессии гена hERG в клонах при помощи обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). В качестве матрицы использовали суммарную РНК, выделенную из клеток клона с применением RNe-asy mini kit ("Qiagen", Германия), согласно протоколу производителя. Синтез первой цепи проводили с использованием обратной транскриптазы SuperScript III ("Invitrogen", США) согласно протоколу производителя.
ОТ-ПЦР проводили со специфичными к центральной части гена hERG праймерами: hERG-f: 5'-TTT GTG GAC CTC AAG GGC GA-3', hERG-r 5'-TTCATG TCG ATG CCG TTG GT-3'. Программа ПЦР: 94°С, 30 с; 56°С, 20 с; 72°С, 1 мин 20 с; 25 циклов. Качество РНК и синтез первой цепи контролировали при помощи ОТ-ПЦ^ с праймерами к гену актина: 5'-AAGTACCCCATTGAGCATGGC-3' и 5'-CACAGCTTCTCCTTGATGTCGC-3' [15].
Электрофизиология. Электрическую активность клеток линии HEK-293 и CHO регистрировали методом patch clamp с использованием усилителя Axopatch 200 B, ЦАП-АЦП конвертера DigiData 1322A и пакета лицензионных программ pClamp8.0 (все от "Axon Instruments", США). Системы перфузии обеспечивали смену внеклеточного раствора со скоростью 0.1-1 мл/с [16]. Регистрирующие пипетки содержали (мМ): 140 KCl, 1 MgCl2, 1 BAPTA, 10 HEPES-KOH. Базовый внеклеточный раствор включал (мМ): 140 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES-NaOH. При необходимости NaCl во внеклеточном растворе заменяли на KCl в эквимоляр-
ной концентрации. Эксперименты проводили при температуре 23-25°С.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате селекции клеток на антибиотиках отобрано 26 клонов, устойчивых к G-418 после трансфекции плазмидой pcDNA3/hERG, и 12 клонов, устойчивых к пуромицину после трансфекции pCDH1/HERG. В каждом клоне при помощи ОТ-ПЦР определяли экспрессию гена hERG (рис. 1). Оказалось, что из 26 клонов, полученных при трансфекции плазмидой, только семь экспрессиро-вали ген hERG, что составляет 27% от общего числа клонов. В 9 из 12 клонов, полученных в результате лентивирусной трансфекции, выявлена экспрессия hERG (75%). Поскольку присутствие транскриптов не гарантировало правильный транспорт и встраивание канального белка в плазматическую мембрану, а также его функциональную активность
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.