УДК 57.577.2::615.27
КЛЕТОЧНЫЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ПОИСКА МОДУЛЯТОРОВ АКТИВНОСТИ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ
© 2014 г. М. Х. Салимгареева, С. В. Садовников, Е. И. Фарафонтова, Л. Ф. Зайнуллина, В. А. Вахитов, Ю. В. Вахитова
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054, Уфа
e-mail: juvv73@gmail.com Поступила в редакцию 17.04.2013 г.
На основе репортерных люциферазных конструкций, содержащих сайты связывания транскрипционных факторов CREB, NFAT, NF-кВ, p53, STAT1, GAS, VDR, HSF1 и HIFla, получены тест-системы для мониторинга активности и поиска веществ — активаторов или ингибиторов биомишеней — транскрипционных факторов. Оценку функциональной активности репортерных конструкций проводили путем их транзиентной трансфекции в клетки линии HEK293 с последующей обработкой специфическими индукторами. Показана функциональная активность всех репортерных конструкций, о чем судили по увеличению экспрессии люциферазы. Для доказательства работоспособности предложенных тест-систем использовали аспирин. Показано, что инкубация трансфециро-ванных репортерными конструкциями клеток в присутствии аспирина сопровождается подавлением связывающей активности NF-кВ, HIFla, GAS, VDR и HSF. Полученные нами данные в отношении NF-кВ, NFAT и STAT1 подтверждают литературные сведения о механизмах действия аспирина. Выявленные эффекты препарата на активность HIFla, GAS, VDR, CREB и HSF показаны впервые.
DOI: 10.7868/S0555109914020159
Биологический скрининг in vitro рассматривается в настоящее время в качестве ключевой технологии для характеристики свойств новых химических соединений на ранних этапах процесса поиска и разработки лекарственных средств. Непосредственным результатом тестирования in vitro являются данные о закономерностях зависимости между структурными особенностями молекул и их специфической активностью к отдельным мишеням, что, в свою очередь, позволяет направленно отбирать наиболее эффективные соединения для последующих этапов доклинических исследований.
На данный момент известно около 500 мишеней, с влиянием на которые связана фармакологическая активность применяющихся терапевтических средств. Среди них значительная часть приходится на рецепторы, в частности мембранные G-белок сопряженные рецепторы (GPCR), лиганд-управляемые ионные каналы, рецепторы факторов роста, ферменты, в том числе, тирозин-, и серин-треониновые киназы, ионные каналы, ядерные рецепторы, мембранные транспортеры, ДНК и ряд других [1, 2]. В последние несколько лет особый интерес вызывают транскрипционные факторы (ТФ) в качестве перспективных терапевтических мишеней для противоопухолевых, противовоспалительных и иммунотропных лекарственных средств [3—5]. К настоящему време-
ни обнаружено значительное число соединений, ингибиторов или индукторов различных ТФ и доказана их терапевтическая эффективность [6— 14]. Отметим, что рациональный отбор соединений — перспективных терапевтических агентов, способных оказывать влияние на активность транскрипционных факторов, является актуальным направлением и требует соответствующих систем in vitro скрининга.
Одним из наиболее эффективных скрининго-вых подходов к поиску соединений, влияющих на активность транскрипционных факторов, является использование клеточных линий, стабильно экспрессирующих люциферазные репортерные конструкции с сайтами связывания определенных ТФ [15]. Люциферазные репортерные векторы представляют собой генетические конструкции, которые содержат модельный промотор, представляющий собой участок связывания и активации ТФ, при этом репортерный ген (ген лю-циферазы) находится под контролем данного промотора. Связывание ТФ с сайтом узнавания приводит к экспрессии гена люциферазы и биолюминесценции, детектируемой при внесении субстрата люциферина. Уровень биолюминесценции прямо пропорционален количеству фермента и связывающей активности того или иного транскрипционного фактора. Принцип тест-систем для биологического скрининга соединений
Таблица 1. Олигонуклеотидные последовательности для клонирования в репортерный вектор pTL-Luc
Сайт связывания Последовательность вставки (5'—3')
GAS 5'-АGGTTTCCGGGAAAGCAGTAGGTTTAGGTTTCCGGGAAAGCAGTAGGTTT-3'
NF-kB 5'-GGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCC-3'
CRE 5'-GCACCAGACAGTGACGTCATGGCCGTCATGACGTCACCCCATTGACGTCAATGGGAGAAC-3'
STAT1 5'-GTATTTCCCAGAAAAGGAACGTATTTCCCAGAAAAGGAACGTATTTCCCAGAAAAGGAAC-3'
HIF1a 5'-GTGACTACGTGCTGCCTAGGTGACTACGTGCTGCCTAGGTGACTACGTGCTGCCT-AGGTGACTACGTGCTGCCTAG-3'
HSE 5 '-CTGGAATTTTCTAGACTGGAATTTTCTAGACTGGAATTTTCTAGA-3'
NFAT 5'-GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT-GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT-3'
VDRE 5'-TTCAGGTCAAGGAGGTCAAGGAGGTCAAGGAGGTCA-3'
р53 5'-TACAGAACATGTCTAAGCATGCTGTGCCTTGCCTGGACTTGCCTGGCCTTGCCTTGGG-3'
на предмет их влияния на тот или иной ТФ основан на том, что, если тестируемое соединение стимулирует или ингибирует активность ТФ, то будет наблюдаться увеличение/снижение уровня люминесценции (вследствие изменения ДНК-связывающей активности ТФ). Таким образом, становится возможным отбирать соединения, мишенями для которых являются транскрипционные факторы и исследовать механизмы действия как новых, так и уже применяющихся лекарств.
Цель работы — получение люциферазных ре-портерных конструкций и создание на их основе тест-систем для идентификации соединений — индукторов/ингибиторов фармакологически значимых транскрипционных факторов.
МЕТОДИКА
Создание репортерных векторных конструкций.
Олигонуклеотиды ("Синтол", Россия), содержащие несколько копий последовательностей, соответствующих сайтам связывания отдельных ТФ (табл. 1), были клонированы в плазмидном векторе pTL-Luc ("Panomics", США; несет ген люци-феразы Photinus pyralis) по сайтам рестрикции NheI (5'-G^CTAGC-3') и BgII (5'-A^GATCT-3') ("Fermentas", Литва). Данный репортерный лю-циферазный вектор содержит минимальный промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса, активность которого зависит от вышележащей консенсусной последовательности, способной связывать определенный ТФ. В свою очередь экспрессия гена люциферазы находится под контролем данного модельного промотора. Наличие и ориентацию вставок подтверждали секвенирова-нием согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ("Applied Biosystems", США). Выделение и очист-
ку плазмидной ДНК проводили с помощью набора EndoFree Plasmid Maxi Kit ("Qiagen", США).
Культивирование клеток. В работе использовались клетки линии HEK293 (Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки культивировали при 37°С при 5% CO2 в среде DMEM ("Биолот", Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", США), 2 мМ L-глута-мина, 50 мкг/мл гентамицина сульфата, 2.5 мкг/мл амфотерицина B ("ПанЭко", Россия).
Трансфекция. Для проведения транзиентных трансфекций клетки линии HEK293 рассаживали в количестве 45 х 103 кл. на лунку в 96-луночных планшетах в 100 мкл среды без антибиотика (DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина). Через 24 ч проводили трансфекции с помощью реагента Липофектамин 2000 ("Invitrogen", США) согласно протоколу изготовителя. Через 6 ч после трансфекции среду заменяли на содержащую антибиотик (DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицин, 2.5 мкг/мл амфотерицин В) и далее использовали для оценки функциональности репортерных конструкций.
Анализ активности люциферазных репортерных конструкций. Клетки НЕК293 трансфецировали репортерной конструкцией, содержащей последовательность связывания конкретного ТФ (опытный вариант ТФ-luc), и вносили специфический индуктор (опытный вариант ТФ-luc + индуктор). В контрольном варианте клетки транс -фецировали репортерным вектором, не несущим каких-либо вставок (контрольный вариант TA-luc), и также обрабатывали индуктором (контрольный вариант TA-luc + индуктор). Активность люциферазы Photinus pyralis нормализовали относительно активности Renilla reniformis. Уро-
Таблица 2. Определение функциональной активности репортерных конструкций, содержащих сайты связывания транскрипционных факторов (среднее арифм. ± станд. ошибка среднего, n = 3)
Репортерная конструкция Условия индукции Изменения уровня экспрессии люциферазы
NF-KB-Luc TNFa (20 нг/мл), 14 ч 10.3 ± 1.02** (9)
NFAT-Luc Форбол-12-миристат-13-ацетат (10 нг/мл) + иономицин (1 мкМ), 14 ч 9.7 ± 0.53** (12)
CRE-Luc Форсколин (10 мкМ), 6 ч 9.8 ± 1.4* (9)
HIF1a-Luc CoCl2 (100 мкМ), 15 ч 20.5 ± 3.55* (12)
HSE-Luc 42° С, 1ч 3.8 ± 0.51* (18)
рбЗ-Luc Трихостатин А (0.5 мкМ), 14 ч 27 ± 2.87** (9)
VDRE-Luc Кальцитриол (0.05 мкМ), 6 ч 4.2 ± 0.75* (9)
GAS-Luc IFNy (100 нг/мл), 14 ч 3 ± 0.5* (9)
STATl-Luc IFNy (100 нг/мл), 14 ч 2.7 ± 0.46* (9)
Примечание. Достоверность различий оценивали с помощью парного ¿-критерия Стьюдента для зависимых выборок. *р < 0.05, **р < 0.01.
вень индукции люциферазы рассчитывали по соотношению:
( ТФ - lue + индуктор ) | ТФ - lue (ТА-luc + индуктор) |TA-luc
С целью проверки функциональности репортерных конструкций в среду для культивирования клетки после транзиентной трансфекции вносили специфичные для каждого ТФ индукторы (табл. 2). Использовались индукторы следующих производителей: фактор некроза опухолей а (TNFa; "Promega", США), иономицин, интерферон у (IFNy; "Invitrogen", США), форбол-12-ми-ристат-13-ацетат, форсколин, трихостатин А, кальцитриол ("Tocris Bioscience", США), хлорид кобальта (CoCl2; "Sigma", США). Определение активности люциферазы в клеточных лизатах проводили с помощью набора для двойного лю-циферазного анализа Dual-Luciferase Reporter Assay System ("Promega", США), используя мульти-планшетный анализатор 2300 EnSpire® Multimode Plate Readers ("Perkin Elmer", США). Для нормализации полученных результатов клетки ко-трансфецировали плазмидой pRL-TK ("Promega", США), кодирующей ген люциферазы Renilla reniformis.
Анализ ДНК-связывающей активности известного фармакологического агента. Клетки линии HEK293 рассаживали в количестве 45 х 103 кл. на лунку в 96-луночных планшетах в 100 мкл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.