МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 4, с. 436-444
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 582.282.22.083.3
КЛЕТОЧНЫЙ И КАЛЬЦИЕВЫЙ ОТВЕТЫ ASPERGILLUS AWAMORI НА ВОЗДЕЙСТВИЕ АМФОТЕРИЦИНОМ
© 2014 г. А. А. Абдельрахман*, О. В. Козлова**, С. М. А. Эльшафей*, Ф. К. Алимова***, Ф. Г. Куприянова-Ашина***' 1
*Факультет сельского хозяйства, Университет Минья, г. Эль-Минья, Египет **Эдингбургский университет, Великобритания ***Казанский (Приволжский) федеральный университет Поступила в редакцию 13.10.2013 г.
В экспериментах с мутантным штаммом Aspergillus awamori 66А, содержащим рекомбинантный Са2+-зависимый фоточувствительный белок экворин, изучены клеточный и Са2+-ответы на стрес-сорное воздействие пермеабилизующего фунгицида — амфотерицина В. Клеточный ответ, который фиксировали по изменениям роста и развития микромицета (инициации прорастания спор, роста мицелия, интенсивности спорообразования), был дозозависим. Амфотерицин в низких концентрациях (2.5 мкМ) стимулировал процессы прорастания спор: количество спор с ростковой трубкой увеличивалось в 2—3 раза по сравнению с контролем (среда без фунгицида). С увеличением концентрации фунгицида до 20 мкМ прорастание спор ингибировалось. Дозозависимый эффект амфоте-рицина был подтвержден по показателям разрастания мицелия и интенсивности спорообразования при культивировании микромицета на плотной среде Вогеля. Содержание внутриклеточного Са2+, которое регистрировали по интенсивности люминесценции экворина, также дозозависимо изменялось при воздействии амфотерицина: при внесении в культуру высоких концентраций (10, 20 мкМ) фунгицида в клетках A. awamori обнаруживалось резкое повышение уровня Са2+ (кальциевые вспышки). Повышенный уровень внутриклеточного Са2+ при воздействии высоких доз амфотерицина не снижался до исходного на протяжении всего эксперимента (360 с), что коррелировало с угнетением роста и развития гриба. Обсуждается возможность использования штамма A. awamori c рекомбинантным экворином в качестве тестерного организма для отбора соединений с фунгицид-ной активностью.
Ключевые слова: Aspergillus awamori, рекомбинантный экворин, пермеабилизующий фунгицид амфотерицин В, клеточный ответ, рост мицелия, спорообразование, Са2+-ответ, динамика Са2+.
DOI: 10.7868/S0026365614040028
Одним из важных направлений защиты растений от фитопатогенной микрофлоры, в том числе от фитопатогенных микромицетов, является поиск соединений с фунгицидной активностью. Хорошие результаты дает обработка семян ячменя препаратами микробного происхождения, которые обеспечивают снижение количества плесневых грибов [1]. Вместе с тем частота встречаемости микромицетов рода Aspergillus, потенциально патогенных для человека, остается высокой [2]. Токсичность грибов рода Aspergillus и их выраженная устойчивость к различным фунгицидам обусловливают поиск новых биологически активных веществ, среди которых перспективным оказался амфотерицин В, активный в отношении многих фитопатогенных грибов, возбудителей различных заболеваний, в том числе не поддающихся
1 Автор для корреспонденции (e-mail: flera.ashina@kpfu.ru).
лечению другими противогрибковыми препаратами [3—5].
Как представитель полиеновых антибиотиков амфотерицин обладает способностью увеличивать проницаемость мембран для ионов [6, 7], в том числе и для ионов кальция, который имеет сигнальные функции для контроля целого ряда процессов, происходящих в эукариотической клетке. Сигнальные функции кальция хорошо изучены у животных и растительных организмов [8, 9]. Для мицелиальных грибов известны сигнальные функции Са2+ в развитии апоптозной реакции [10, 11]. Однако в современной физиологии остается много неясного в вопросах кальциевой сигнализации при стрессорных воздействиях, когда нарушения кальциевого гомеостаза будут влиять на функционирование Са2+-сигнальных систем, физиологические процессы и сохранение жизнеспособности клеток. При нарушении каль-
циевого гомеостаза события в клетке могут протекать по разным сценариям, с одной стороны, обусловливая вызванный разрегулированностью кальция процесс токсичности, с другой — включение путей репарации повреждений, где Са2+ играет определяющую роль как посредник в транс-дукции сигнальных каскадов [12]. Реализация определенной программы будет зависеть от степени нарушения Са2+-гомеостаза в клетке при воздействии конкретных физиологических стимулов. Для определения возможных сценариев стрессового ответа, в том числе результативность применения фунгицида, необходимо иметь тест-систему, которая позволила бы анализировать зависимость изменения процессов роста и развития микроми-цета от уровня внутриклеточного кальция.
Целью работы было оценить взаимосвязь между ростом и развитием мутантного штамма Äspergülus awamori, содержащего рекомбинант-ный белок экворин, и изменением содержания ионов Са2+ в цитозоле гриба, вызванным воздействием на микромицет пермеабилизующего фунгицида — амфотерицина В.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования был мутантный штамм Aspergillus awamori 66А, экспрессирующий фотозависимый белок экворин (штамм любезно предоставлен лабораторией исследования клеток микромицетов Эдинбургского университета) [13].
Штамм Ä. awamori 66А культивировали при 30°C в жидкой среде Вогеля с добавлением сахарозы (среда ВС) и на плотной среде (2% агара) того же состава, обогащенной глюкозой (среда ОСГ) [14]. Эксперименты проводили на моноспоровой культуре Ä. awamori 66А, для получения которой готовили конидиальную суспензию гриба с титром 20—30 спор/мл. На поверхности жидкой среды Вогеля гриб рос в виде отдельных микроколоний, которые через 24 ч инкубации переносили на плотную среду Вогеля. После 7 сут выращивания поверхностной культуры споры смывали 0.8% раствором NaCl (PZ), отмывали от среды и остатков мицелия (центрифугирование, 3000 g, 15 мин), ресуспендировали в растворе (PZ) и хранили при 4°C. Концентрацию спор определяли подсчетом в камере Горяева. Плотность суспензии спор, используемой в опытах, составляла 3 х 105 спор/мл.
В качестве стрессорного фактора использовали фунгицид, амфотерицин В ("Sigma") — поли-еновый антибиотик, синтезируемый актиноми-цетами рода Streptomyces, для которого известны синонимы: Amfostat, Amphotericin B, Fungilin, Fundizone и др. [3]. Влияние амфотерицина на развитие Ä. awamori определяли при его внесении в культуры микромицета разных фаз роста.
О влиянии амфотерицина на процессы прорастания спор судили по скорости их набухания и количеству спор с ростковой трубкой. При подборе концентраций амфотерицина учитывали, что высокие дозы антибиотика оказывают фунгицидное действие на микромицет, а средние дозы — статический эффект, когда блокируются функции размножения при сохранении жизнеспособности клеток. При изучении фунгицидного действия амфотерицин использовали в диапазоне концентраций: 2.5, 10 и 20 мкМ. Набухание спор анализировали в капле жидкой среды Вогеля (10 мкл) на стекле при концентрации 3 х 105 спор/мл и содержании амфотерицина в каждой пробе от 2.5 до 20 мкМ. Во избежание высыхания среды стекла со спорами помещали во влажную камеру (100% влажности) и выдерживали при 30°C в течение 6 ч. В опытном и контрольном (среда без фунгицида) вариантах через каждые 2 ч с помощью окуляр-микрометра измеряли диаметр спор (d, мкм) (микроскоп Zeiss, Axio Imager 2).
Прорастание спор исследовали при их инкубации (30°C) в жидкой среде Вогеля в пробирках при концентрации спор 3 х 105 /мл и содержании амфотерицина 2.5, 10, 20 мкМ. В течение 24 ч инкубации регистрировали количество спор с про-ростковой трубкой (начало лаг-фазы) и определяли ветвление ростковой трубки (начало экспоненциальной фазы). Количество спор с ростковой трубкой и ответвления гиф от главной проростко-вой трубки подсчитывали в камере Горяева в 20 полях зрения.
О действии фунгицида на качество погруженной культуры A. awamori, используемой как посевной материал, судили по степени разрастания мицелия на плотной среде Вогеля (радиус колонии, мм). Для этого споры (3 х 105 спор/мл) засевали в жидкую среду Вогеля и инкубировали в течение 24 ч (начало фазы экспоненциального роста). В выросшую культуру A. awamori добавляли амфотерицин в разных концентрациях (2.5, 10, 20 мкМ) и продолжали инкубирование в течение 24 ч, после чего аликвоты выросшей культуры (0.1 мкл) высевали на агаризованную среду и выращивали при 30°C в течение 7 сут. Радиус колоний миромицета измеряли через каждые 24 ч и высчитывали общую и удельную скорости роста гриба по методу [15].
Влияние амфотерицина на спорообразование A. awamori изучали в условиях эксперимента, описанных выше. Суточную культуру A. awamori, выросшую в пробирках со средой Вогеля, содержащей амфотерицин (2.5, 10, 20 мкМ), высевали (0.1 мкл) на плотную среду Вогеля. Через каждые 24 ч в течение 7 сут роста гриба вдоль линии окружности колонии лабораторным сверлом вырезали блоки агаровой культуры, которые помещали в жидкую среду и для освобождения спор встряхивали (15 мин) на качалке (200 об/мин). Количество спор в расчете на 1 мл взвеси подсчитывали в камере Горяева.
(а)
d, мкм 4
6
Время, ч
d, мкм 4
(б)
6
Время, ч
d, мкм 4
(в)
0 2 4 6
Время, ч
Рис. 1. Динамика набухания спор A. awamori (d, мкм) при инкубации в среде Вогеля, содержащей амфотерицин: 1 — среда без фунгицида; 2 — варианты опыта с фунгицидом в дозах: а — 2.5, б — 10, в — 20 мкМ соответственно.
Влияние амфотерицина на содержание кальция в цитозоле А. awamori определяли по люминесценции рекомбинантного экворина [16]. Люминесценцию экворина измеряли в клетках культуры, которую выращивали в жидкой среде Вогеля в 96-клеточном планшете как описано ранее [17]. В каждую ячейку планшета вносили 100 мкл суспензии спор с начальной концентрацией 5 х 105 клеток/мл и инкубировали при 30°C в течение 24 ч до достижения начала фазы экспоненциального роста. Затем в культуры A. awamori вносили селентра-зин и инкубировали в течение 4 ч для восстановления экворина. После этого в каждую ячейку с культурой вносили амфотерицин в концентрациях: 2.5, 10, 20 мкМ (в контрольные образцы вносили в тех же объема
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.