ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 453, № 5, с. 574-576
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 611.018.4:57.017.642:576.535.5
КЛОНАЛЬНЫЙ РОСТ, ФЕНОТИП И ПОТЕНЦИИ К ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК
ИЗ КОСТИ ПЛОДОВ КРЫСЫ
© 2013 г. О. В. Паюшина, Н. Н. Буторина, О. Н. Шевелева, С. С. Бухинник, Е. И. Домарацкая
Представлено академиком М.В. Угрюмовым 28.03.2013 г. Поступило 01.04.2013 г.
БО1: 10.7868/80869565213350260
Исследование мезенхимных стромальных клеток (МСК) принадлежит к приоритетным направлениям современной биологии. Одна из важнейших функций МСК состоит в организации кроветворного микроокружения. Первоначально выделенные из костного мозга, селезенки и тимуса как колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф) [1], впоследствии они были обнаружены во всех органах транзиторного и дефинитивного гемопоэза. Корреляция между содержанием КОЕ-Ф и кроветворных стволовых клеток в этих органах на разных стадиях онтогенеза может косвенно свидетельствовать о последовательной смене локализации МСК, подготавливающих нишу для кроветворных клеток [2]. По-видимому, в ходе онтогенеза МСК претерпевают определенные изменения. В частности, известно, что в пренатальный период клетки стромы костного мозга человека обладают большими, чем у взрослых доноров, про-лиферативной активностью и потенциями к диф-ференцировке [3, 4], но меньшей способностью поддерживать кроветворение [5]. Однако вопрос об изменении свойств МСК в онтогенезе изучен недостаточно. Анализ особенностей этих клеток в кроветворных органах развивающегося и зрелого организма позволяет пролить свет на процесс становления кроветворной системы. В частности, представляет интерес охарактеризовать МСК, содержащиеся в кости плода до начала активного гемопоэза, в сравнении с клетками стромы зрелого костного мозга, что стало предметом настоящего исследования.
Гистологический анализ срезов бедренной кости 20-суточных плодов крыс Щ81аг показал, что в ней отсутствует явно выраженная костно-мозго-вая полость, эпифизы представлены хрящевой
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва
тканью, а диафиз заполнен сетью костных трабе-кул, между которыми расположены участки разрушающегося хряща, многочисленные мезен-химные клетки и небольшое число кроветворных. Клетки, выделенные из кости путем обработки 0.1%-м раствором коллагеназы и помещенные в среду а-МЕМ с 10% сыворотки плодов коровы, при посеве с плотностью (1—2) • 105 клеток/мл уже через трое суток образовывали субконфлюэнт-ный монослой фибробластов. Формирование дискретных колоний требовало посева с плотностью (1—4) • 103 клеток/мл и происходило через 6— 12 сут роста. Эффективность клонирования КОЕ-Ф более чем на два порядка превышала таковую для клеток из костного мозга половозрелых крыс. При этом активность щелочной фос-фатазы, характерная для остеогенных клеток и присутствующая в большинстве колоний, образуемых клетками зрелого костного мозга, в культуре КОЕ-Ф зародышевой кости отмечалась редко (табл. 1). Вероятно, различия в эффективности
Таблица 1. Эффективность клонирования КОЕ-Ф и активность щелочной фосфатазы в образуемых ими колониях
Источник клеток Эффективность клонирования, КОЕ-Ф на 1 млн клеток Доля колоний, содержащих ЩФ+ клетки, %
Кость плодов 5515.88 ± 1211.51 4.72 ± 1.10
4708.33 ± 342.13 0.59 ± 0.63
9819.44 ± 862.75 7.00 ± 1.08
Зрелый кост- 16.00 ± 1.19 60.71 ± 3.66
ный мозг 16.77 ± 1.13 95.71 ± 3.83
13.11 ± 0.89 94.32 ± 0.58
Примечание. Для каждого варианта представлены средние значения со стандартными ошибками по каждому из трех повторов эксперимента.
КЛОНАЛЬНЫЙ РОСТ, ФЕНОТИП И ПОТЕНЦИИ
575
(а)
(б)
щ
г г
т, %
л "
Рис. 1. Экспрессия маркеров МСК в первичной культуре клеток кости плодов: а — ПЦР-анализ экспрессии генов CD73, CD90 и CD105; б — окрашивание мо-ноклональными антителами к CD90.
клонирования стромальных клеток из двух источников связаны с тем, что, в отличие от зрелого костного мозга, состоящего большей частью из кроветворных клеток, в кости плода преобладают способные к клональному росту механоциты. Кроме того, в формирование колоний клетками из зародышевой кости помимо зачатка костного мозга вносят вклад надкостница, костная, хрящевая ткани и, возможно, примесь тканей суставной сумки, мышц и сухожилий. Все они известны как источники МСК [6—9], причем содержание по-
следних в плотных тканях значительно выше, чем в костном мозге [8, 9].
ПЦР-анализ на мРНК СЭ73, СЭ90 и СЭ105 -маркеров, рекомендуемых для идентификации МСК человека [10] и обнаруженных ранее в культурах стромальных клеток зрелого костного мозга крысы [11], — показал выраженную экспрессию в первичной культуре зародышевой кости генов СЭ90 и СЭ105; мРНК СЭ73 выявлялась на низком уровне или отсутствовала (рис. 1а). Иммуно-цитохимический анализ подтвердил присутствие на большинстве клеток СЭ90 (рис. 1б), но не СЭ73. Возможно, низкий уровень экспрессии СЭ73, участвующего, по некоторым данным, в регуляции гемопоэза [12], отражает функциональную незрелость формирующейся кроветворной стромы.
Оценка потенций стромальных клеток из кости плодов к остеогенезу и адипогенезу в соответствующих индукционных средах [11] показала их способность к дифференцировке в обоих направлениях. После 19—21 сут культивирования в остеогенной среде формировались мелкие плотные скопления базофильных кубических клеток, как правило, содержащие щелочную фосфатазу (ЩФ). Некоторые такие скопления демонстрировали слабую реакцию на Са2+; в их отдельных клетках иммуноци-тохимически выявлялся специфический маркер остеобластов остеокальцин. Крупные минерализованные костные узелки, типичные для остео-генной дифференцировки МСК из костного мозга половозрелых крыс [11], практически отсутствовали. Таким образом, остеогенные потенции клеток из зародышевой кости были сравнительно слабыми, что согласуется с малочисленностью клеток, содержащих ЩФ, в колониях, образуемых КОЕ-Ф из этого источника. В то же время клетки из кости плодов проявляли выраженную способность к адипогенезу, причем не только в соответствующей индукционной среде, но и в остеогенной,
Рис. 2. Дифференцировка МСК из кости плодов в индукционных средах: а — остеогенез, 19 сут индукции, цитохимическая реакция на ЩФ, ядра окрашены гематоксилином; б — адипогенез, 12 сут индукции, окрашивание жировым красным О и гематоксилином.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 453 № 5 2013
576
ПАЮШИНА и др.
а также спонтанно в отсутствие индукторов. Одиночные или расположенные рыхлыми кластерами клетки с включениями нейтральных жиров появлялись после 4—7 сут культивирования; после 10— 12 сут очаги дифференцировки представляли собой крупные скопления округлых клеток с множественными жировыми вакуолями (рис. 2б). Судя по срокам образования жировых клеток, их численности и степени зрелости, адипогенные потенции МСК из кости плода сопоставимы с таковыми клеток зрелого костного мозга [11].
Полученные данные свидетельствуют о том, что по фенотипу и потенциям стромальные клетки, содержащиеся в тканях кости на поздних стадиях пренатального онтогенеза, в целом соответствуют критериям МСК, но отличаются от присутствующих в строме зрелого костного мозга слабой экспрессией CD73 и меньшей способностью к остеогенезу. Последнее обстоятельство выглядит неожиданным, учитывая активное формирование костной ткани в конечностях плода. Согласно сообщениям других авторов, МСК костного мозга плода превосходят по остеогенным потенциям полученные от половозрелых доноров; впрочем, большинство подобных исследований выполнены на клетках человека [3, 4]. Помимо возможных видовых различий несоответствия в результатах могут быть связаны и с невозможностью получения от плода крысы развивающегося костного мозга в чистом виде, без примеси окружающих тканей — кости, хряща, надкостницы и т.п. МСК из этих тканей охарактеризованы главным образом в постнатальном онтогенезе [6—8]; их свойства (и, в частности, остеогенные потенции) у зародышей остаются малоизученными. Очевидно,
при интерпретации полученных нами результатов необходимо учитывать вклад клеток из этих источников. Исследования, направленные на детальную характеристику фенотипа и потенций МСК костного мозга и других тканей на разных стадиях пре- и постнатального онтогенеза, будут продолжены.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. // Exp. Hematol. 1976. V. 4. № 5. P. 267-274.
2. Van Den HeuvelR.L., Versele S.R.M., O. Schoeters G.E.R., Vanderborght O.L. // Brit. J. Haematol. 1987. V 66. № 1. P. 15-20.
3. Hu Y., Ma L., Jiang X., Zhao C. // Zhonghua Xue Yfe Xue Za Zhi. 2002. V. 23. № 12. P. 645-648.
4. Guillot P. V., De Bari C, Dell'Accio F, et al. // Differentiation. 2008. V. 76. № 9. P. 946-957.
5. Liu M., Yang S.G., Xing W., et al. // Zhonghua Xue Yfe Xue Za Zhi. 2011. V. 19. № 4. P. 1028-1032.
6. Noth U., Osyczka A.M., Tuli R., et al. // J. Orthop. Res. 2002. V. 20. № 5. P. 1060-1069.
7. Mirmalek-Sani S.-H., Tare R.S., Morgan S.M., et al. // Stem Cells. 2006. V. 24. № 4. P. 1042-1053.
8. Yoshimura H., Muneta T., Nimura A., et al. // Cell Tissue Res. 2007. V. 327. № 3. P. 449-462.
9. Tan Q., Liu P.P., Rui Y.F., Wong Y.M. // Tissue Eng. Pt A. 2012. V. 18. № 7/8. P. 840-851.
10. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., et al. // Cytother-apy. 2006. V. 8. № 4. P. 315-317.
11. Кожевникова М.Н., Микаелян А.С., Старостин В.И.// Цитология. 2009. Т. 51. № 6. С. 526-538.
12. Barry F., Boynton R., Murphy M., et al. // Biochem. and Biophys. Res. Communs. 2001. V. 289. № 2. P. 519-524.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 453 № 5 2013
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.