БИООРГАНИЧЕСКАЯ
Том 19 *
ХИМИЯ
№ 1 * 1993
УДК 577.214.622
© 1993 К. Б. Игнатов, Л. Г. Чистякова, О. Б. Шемчукова, С. Б. Городецкая, В. И. Киселев
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА ЭНТЕРОТОКСИНА В Staphylococcus aureus, ПОЛУЧЕННОГО МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ, И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ В КЛЕТКАХ
Escherichia coli
Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, Москва
Предложен новый подход к определению эотсротоксигенности Staphylococcus aureus, в .основе которого лежит метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). С помощью данного метода проведен скрининг штаммов S. aureus на наличие гена энтерогоксина В. Фрагмент ДНК выбранного штамма (FRI 722Н), содержащий ген энтерогоксина В, был получен методом ПЦР и клонирован в векторе pUC19. Было показано, что энтеротоксин В с лидерным пептидом в клетках Escherichia coli образует нерастворимые комплексы, а зрелый токсин находится в цитоплазматической фракции в растворимом состоянии. Суммарный выход рекомбинантного токсина в Е. coli JMI09 составил 1,7% общего клеточного белка.
Стафилококковые энтеротоксины (SE) — это белки с молекулярной массой около 30 к Да, По серологическим признакам они разделены на пять групп: А, В, С, D, Е [1 ]. SE вызывают в организме человека и животных синдром пищевого отравления [1] и неспецифическую стимуляцию иммунитета [2]. В 60% случаев штаммы Staphylococcus aureus, выделенные от больных гнойно-септическими заболеваниями, продуцируют энтеротоксины типа А и В [3 ].
Стафилококковый энтеротоксин В (SEB) относится к числу мощных иммуностимуляторов. В низких концентрациях (Ю-12—10~9 М) он вызывает пролиферацию Т-лимфоцитов и индуцирует синтез у-интерферона и интерлейкина-2 [4, 5]. Свойства SEB определяются его способностью связываться с а/З-рецепторами Т-лимфоцитов с высокой эффективностью [6 ]. Благодаря своим иммуностимулирующим свойствам SEB представляет интерес в качестве основы для создания иммуностимуляторов. Аминокислотная последовательность и структура гена эн-теротоксина В (епЖ-ген) были определены ранее [7, 8].
Клонированию гена SEB предшествовал выбор штамма S, aureus, содержащего eniB-гсн.
Способность штаммов S. aureus продуцировать тот или иной тип энтеротоксинов до настоящего времени определялась иммунологическими методами. Однако благодаря большой гомологии антигенных детерминант антитела, полученные к одному типу SE, дают значительную перекрестную реакцию с другими энтеро-токсинами. Кроме того, один штамм стафилококка может продуцировать несколько типов энтеротоксинов. Все это не позволяет однозначно определить энтероток-сигенность штаммов S. aureus.
Для прямого обнаружения генов SE в геноме стафилококка нами был разработан подход на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Специфичность данного метода обнаружения определяется выбором ограничивающих олигонуклеотидных
л.о. 2.3130
дч1б-
5557 4361
2322. 2027
603
Рис. 1. Электрофорез в 1% агарозном геле образцов, полученных в результате амплификации ДНК S. aureus FRI 722(H) (2), FRI 722 (5), клинического изолята к/к64 (.4) и к/к87 (J) с праймерами P1/I и Р2 (а), Р1/2 и Р2 (б). Дорожка 1 — маркеры, мол. массы DRIges ¡"'ill (Pharmacia)
праймеров, способных связываться только с уникальными участками ДНК, расположенными друг от друга на заданном расстоянии.
В результате анализа первичной структуры еиШ-гена по программе «PRIMER», любезно предоставленной С. Л. Васильевым, для последующего анализа генома стафилококков были выбраны следующие пары праймеров:
а) пара, ограничивающая участок ДНК длиной 1135 п. о., P'/i (5')AAG1TTAGGTGATGTATAGTTAC
Р2 (5')GTGAAAACTATAATGGCAACAA,
б) пара, ограничивающая участок ДНК длиной 877 п. о., Р'/г (5')TTAGCAGAGAGTCAACCAGATCC
Р2 (5') GTGAAAACTATAATGGCAACAA.
Для определения штамма S. aureus, содержащего ген энтеротоксина В, с помощью ПЦР были проанализированы геномные ДНК клинических изолятов
î ' 2 .» 3 Ч V S-
Рис. 2. Электрофорез в 12% ПААГ лизатов клеток Е. coli с гглазмидой pUC19 (4), плазмидой pUSB без индукции (3) и при индукции IPTG в течение 1 (2) и 2 ч (/). Дорожка 5 — маркеры, мол. массы
к/к 64, к/к 87 и штаммов FRI 722(H) и FRI 722. Амплификацию проводили в течение 30 циклов в следующем режиме: 93" С — 1 мин; 58° С — 1 мин; 72° С — 1 мин. Полученные образцы анализировали электрофорезом в агарозном геле (рис. 1). Специфические полосы амплификации нужной молекулярной массы (1135 и 877 п. о.) наблюдались только в препаратах, содержащих ДНК S. aureus FRI 722(H).
Для клонирования гена entB использовали геномную ДНК отобранного штамма. С помощью ПЦР был получен фрагмент ДНК длиной 1135 п. о., содержащий entB-ген со всеми регуляторными элементами. Полимеразная реакция проводилась в режиме, описанном выше. Общее число циклов не превышало 22 для снижения вероятности внесения мутаций 77/г-ДНК-полимеразой [9 ].
Так как промоторный участок гена entB не узнается РНК-полимеразой Е. coli [10], для обеспечения регулируемой экспрессии ген энтеротоксина В поместили под контроль /ас-промотора в плазмидный вектор pUC19. Чтобы обеспечить нужную ориентацию в векторе, полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК подвергали гидролизу рестриктазой ХЬа\. Участок узнавания данной рестриктазы находится между промоторной областью и SD-последовательностью еп/В-гена [8 ]. После гидролиза фрагмент длиной 990 п. о., содержащий полную структурную часть гена entB, SD-последовательность и терминатор транскрипции, выделяли из агарозного геля и лигировали с ДНК вектора pUC19, обработанной рестриктазами ХЬа\ и S mal. Лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli JM109. Отбор рекомбинантных клонов проводили на среде MacConckey с ампициллином (75 мкг/мл) и контролировали рестриктным анализом. Плазмида, содержащая ген SEB под контролем /ас-промотора, была обозначена нами как pUSB.
1 г
pSEß
SEB
- - -
■
pSEß
**
SEB
: ' 1, ■
-" 1' ' ' > : " : ' . ' 5 ■ '
1
Рис. 3
Рис. 4
Рис. 3. Иммуноблоттинг лизатов клеток £. со/г JM109, содержащих плазмиду pUC19 (!) и рекомбинантную плазмиду pUSB (2)
Рис. 4. Электрофоретический анализ белковых фракций лизатов клеток Е. coli JM109 с рекомбинантным SEB до О) и после центрифугирования (10 000g, 10 мин): 1 — растворимая фракция, 2 — осажденная фракция
Для обнаружения экспрессии глгВ-гена клетки Е. coli JM109 с pUSB наращивали в среде LB с ампициллином до оптического поглощения Аыю 0,8 при 37° С и индуцировали добавлением изопропил-/3-£)-тиогалактопиранозида (IPTG) до 1 мМ. Пробы для белкового электрофореза отбирали через 1 и 2 ч. В качестве контроля использовали те же клетки Е. coli с векторной плазмидой pUC19. Электрофорез лизатов клеток Е. coli JM109, содержащих рекомбинантную плазмиду, при индукции IPTG, выявил две полосы белка с М 31,4 кДа, что соответствует молекулярной массе снтеротоксина В с лидерным пептидом (pSEB), и белка с М 28,5 кДа, что совпадает с молекулярной массой зрелого токсина [8] (рис. 2). Оба индуцибельных белка связываются в иммуноблоттинге с мо-ноклональными антителами S5, специфичными к энтеротоксину В (рис. 3), что позволяет идентифицировать данные белки как энтеротоксин В с лидерным пептидом и зрелый SEB.
Как известно, многие генно-инженерные белки образуют в клетках Е. coli нерастворимые тела включения. Чтобы определить состояние рекомбинантного SEB в Е. coli, бактериальные клетки разрушали ультразвуком и центрифугировали 10 мин при 10 000g. Электрофоретический анализ белков из осадка и надосадочной жидкости показал, что рекомбинантный SEB с лидерным пептидом (pSEB) находился в осажденной фракции, а без лидерного пептида — в растворимом состоянии (рис. 4). При обработке осадка буфером, содержащим 0,2% Triton Х-100, pSEB переходил в раствор. По-видимому, предшественник энтеротоксина В находится в клетках Е. coli в мембраносвязанном состоянии.
Суммарный выход энтеротоксина В в данной системе экспрессии определяли методом dot-ELISA, а общий клеточный белок — методом Лоури [11]. Выход рекомбинантного токсина составил 1,7% общего клеточного белка.
Экспериментальная часть
Бактериальные штаммы, использованные в работе: Е. coli JM109 (recKl, endhl, gy'rA96, thi, hsclRll, supE44, relAl A~, A (lac — proAB), F'[¿raD36, ргоШ, ZacI«Z-M15)), S. aureus FRI 722 и FRI 722(H) получены из НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи; кинетические изоляты — к/к64, к/к87.
Использованы плазмиды pUC19 и pUSB (получена в процессе работы).
Геномную ДНК из S. aureus выделяли как описано ранее [12]. Плазмидную ДНК из клеток Е. coli выделяли по модифицированному методу Бирнбойма и Доли [13]. Клетки Е. coli выращивали в L-бульоне, твердая среда содержала 1,5% агара. Трансформацию клеток Е. coli проводили по методу Ханахана [14].
Полимеразную цепную реакцию проводили на ДНК-амплификаторе фирмы Perkin — Elmer Cetus. Реакционная смесь имела следующий состав: 67 мМ трис-HCl, pH 8,8; 16,6 мМ (NH4)2S04; 1,5 мМ MgCl2; 0,01% Tween 20; dATP, dCTP, dGTP, dTTP, каждый в концентрации 0,25 мМ; 0,3 мкг геномной ДНК; 15 пмоль каждого праймера; 2,5 ед/50 мкл Tth-ДНК-полимеразы. Общий объем смеси составлял 50 мкл. Для предотвращения испарения сверху наслаивалось минеральное масло.
Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы на ДНК-синтезаторе фирмы Applied Biosystems, модель 380 В 02.
В работе были использованы следующие ферменты: ДНК-лигаза фага Т4, рестриктазы Xbal и Smal (Pharmacia); термостабильная Tth-ДНК-полимераза, полученная в отделе молекулярной биологии ВНЦМДЛ.
Для отбора рекомбинантных клонов использовалась среда MacConckey.
Препараты ДНК электрофоретически анализировались в 1 % агарозном геле.
Электрофоретический анализ белков проводился по методу Лэммли [15] в градиентном (5—20%) ПААГ.
Образцы для белкового электрофореза готовили следующим образом. Клетки' Е. coli из 0,5 мл культуры осаждали центрифугированием. К осадку добавляли по 300 мкл воды и фенола (pH 7,5), тщательно ресуспендировали. После центрифугирования к фенольной фракции, содержащей белки, добавляли 5 объемов этилового спирта и инкубировали при 4° С в течение ночи. Белки собирали центрифугированием и растворяли в буфере (0,5 М трис-HCl, pH 6,8; 0,1% SDS; 20% глицер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.