ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 1, с. 25-33
УДК 577.15
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО НОВУЮ АМИЛОМАЛЬТАЗУ ИЗ ПОЧВЕННОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛОДЕКСТРИНОВ С БОЛЬШИМ РАЗМЕРОМ ЦИКЛА
© 2014 г. К. Савазди*, П. Рудикалтамронг**, В. Циммерманн***, С. Мураками****,
П. Понгсавасди*****, Ж. Колпибун******
*Медицинский факультет, Университет Таммасата, Патумтани 12121 Таиланд **Химический факультет, Медицинский колледж Госпиталя Фрамонгкутклао, Банкок 10400 Таиланд ***Кафедра микробиологии и технологии биопроцессов, Институт биохимии Лейпцигского университета,
Лейпциг 04103 Германия
****Факультет сельского хозяйства, Университет Мэйдзи, Хагасимита, Тама-ку, Кавасаки 214-0034Япония *****Биохимический факультет, Университет Чулалонкорна лаборатория исследования крахмала
и циклодекстринов, Банкок 10330 Таиланд ******Медицинский факультет, Университет Таммасата, отделение доклинических исследований (биохимия),
Патумтани 12121 Таиланд e-mail: jkaulpiboon@yahoo.com; kjarunee@tu.ac.th Поступила в редакцию 29.10.2012 г.
Выделен новый ген амиломальтозы из популяций ДНК в образцах почвы, отобранных в горячем источнике Бан Нонг Хрок в Таиланде, без проведения бактериального культивирования. С помощью ПЦР был получен полноразмерный ген (1.5 т.п.н.), который амплифицировали и лигировали в вектор "pGEM®-T easy". Полученный вектор трансформировали в штамм Escherichia coli DH5 а для проведения секвенирования. Полученный ген, кодирующий амиломальтазу, состоял 1503 пар оснований, что соответствовало 500 аминокислотам. Кодируемая этим геном аминокислотная последовательность обладала высокой степенью гомологии с амиломальтазой из Thermus thermophillus АТСС 33923. Для экспрессии фермента клонированный ген субклонировали в плазмиду рЕТ-17Ь, которую потом трансформировали в штамм Е. coli BL21 (DE3). Максимальная экспрессия белка наблюдалась в экспериментах, когда клонированные клетки выращивали при 37°С в течение 6 ч, после чего культуру индуцировали 0.5 мМ ИПТГ. Определенная при помощи электрофореза в ПААГ с Na-ДДС относительная молекулярная масса выделенной амиломальтазы составила ~58 кДа. Выделенный фермент обладал максимальной активностью при 70°C и рН 9.0. Показано, что фермент может гид-ролизовать крахмал из гороха, с образованием циклодекстринов (CD) с большим размером циклов и степенью полимеризации, равной и выше 23. В полученном продукте наибольшую фракцию составили CD29 во всех проведенных экспериментах.
DOI: 10.7868/S0555109913060159
Амиломальтаза (КФ 2.4.1.25) является внутриклеточной 4-а-глюканотрансферазой (4-а-ГТ-аза), которая включает 3 типа 4-а-ГТаз: цикло-декстрингликозилтрансфераза (ЦГГаза, КФ 2.4.1.19), амиломальтаза (AM, КФ 2.4.1.25) и фермент ветвления гликогена (ФВГ, КФ 3.2.1.33) [1]. Фермент катализирует перенос а-1,4-Э-глюкана от донора к акцепторной молекуле, такой как, например, глюкоза или другой а-1,4-глюкан со свободной 4-гидроксильной группой, как показано следующим уравнением:
(а-1,4-глюкан )m + (а-1,4-глюкан )n —— — (а-1,4-глюкан) m _ x + (а-1,4-глюкан) n
(1)
Эту реакцию также называют реакцией дис-пропорционирования. Амиломальтаза также может катализировать реакции циклизации с образованием циклических а-1,4-глюканов (циклодекстринов с большим размером цикла, ЬЯ-СЭ) следующим образом:
(а-1,4-глюкан )n —— циклический (а-1,4-глюкан) x + (а-1,4-глюкан )n
(2)
Обратимая реакция циклизации также называется реакцией связывания. В дополнение к
этим реакциям, было показано, что фермент обладает слабой гидролитической активностью.
В последнее время амиломальтаза вызывает большой интерес из-за возможности ее широкого применения в промышленности и научно-исследовательской работе при получении large-ring cy-clodextrin (LR-CD) со степенью полимеризации (СП) от 16 до 50 [2, 3]. Размер LR-CD намного больше, чем у обычных циклодекстринов с небольшим размером цикла (SR-CD), производимых ЦГТазой. Например, CD26 обладает молекулярной формой схожей с восьмеркой, в которой каждая половина состоит из двух винтообразно-закрученных частей, включающих по 6 остатков глюкозы. Вдоль оси спирали находится гидрофобный канал размером 5—5.5 Ä. Этот канал может образовывать комплексы с включенными гидрофобными молекулами. Было показано, что комплексы LR-CD способствуют улучшению текстуры, вкусовых качеств, аромата и перевариваемости продуктов питания и напитков. Кроме того, они также могут играть важную роль в стабилизации и растворении крупных и нерастворимых или нестабильных молекул лекарственных препаратов в фармацевтической промышленности [4—6]. Другим важным применением LR-CD является их использование в качестве искусственных шапе-ронов при фолдинге белков [7].
Амиломальтаза впервые была обнаружена у Escherichia coli как фермент, индуцируемый мальтозой и который был необходим для метаболизма мальтозы [8]. Ген этого фермента был клонирован из нескольких бактерий, таких как Streptococcus pneumoniae [9], Е. coli [10], Clostridium butyricum NCIMB 7423 [11], гипертермофильной археи Thermococcus litoralis [12], Thermus aquaticus АТСС 33923 [3], Aquifex aeolicus [2] и Pyrobaculum aerophi-lum ИМ2 [13]. Тем не менее, присутствие амило-мальтазы, способной производить LR-CD, было показано только для двух бактериальных штаммов — T. aquaticus АТСС 33923 и А. aeolicus. Ами-ломальтазные гены были получены стандартным методом бактериального культивирования. В последнее время поиск новых генов, полезных ферментов, проводится также и среди некультивиру-емых микроорганизмов, что привело к разработке новой стратегии, включающей скрининг на основе генетических данных, клонирование и ПЦР для выявления новых генов, которые выделяются непосредственно из окружающей среды [14]. Генные объекты, кодирующие ксиланазы и цикло-мальтодекстриназы, были созданы с использованием клонирования с помощью ПЦР [15, 16]. В этой работе впервые, было проведено выделение гена из популяции ДНК, отобранной из горячего источника Бан Нонг Хрок для получения новой амиломальтазы, обладающей способностью катализировать реакцию получения LR-CD. Были исследованы аминокислотная последовательность и биохимические свойства выделенного фермента.
МЕТОДИКА
Плазмиды, штаммы-продуценты, условия роста и реагенты. Для проведения клонирования и се-квенирования ДНК была использована плазмида pGEM®-T Easy ("Promega", США). В качестве штаммов-продуцентов и штаммов для переноса векторов были использованы следующие штаммы E. coli DH5 а, Е. coli BL21 (DE3) и pET-17B, которые были приобретены у "Novagen" (Германия). Все рекомбинантные клетки выращивали в среде Лурия-Бертани (LB) при 37°С, в присутствии ампициллина (100 цг/мл). Ферменты рестрикции, ДНК-лигазы и ДНК-полимеразы были получены из "New England Biolabs" (США). Крахмал из гороха был получен из "EmslandStärke" GmbH (Германия). Стандарты синтетической амилозы и LR^D были любезно предоставлены H. Уеда (Университет Хоши, Токио, Япония). Глюкоамилаза из Rhizopus sp. была получена на фирме "Toyobo Ltd" (Япония). Все другие химические вещества были приобретены у компании "Merck" (Германия).
Выделение ДНК из образцов почвы. Образцы почвы были отобраны в местах расположения горячих источников Бан Нонг Хрок и Пан Бор Хленг (Тайланд), Кавасаки и Камакура (Япония). Почвенные образцы инкубировали в течение 3 сут в 1%-ном растворе картофельного крахмала при 37 и 70°С для скрининга ДНК из мезофильных и термофильных бактерий соответственно. ДНК из почвы экстрагировали Na-ДДС по методике Ма-ниатиса с соавт. [17] с использованием набора ISOIL ("Nippon Gene", Япония). Полученную геномную ДНК очищали с использованием набора QIAquick Gel Extraction ("Qiagen", Германия). Количество выделенной ДНК рассчитывали по поглощению при 260 нм. Чистоту и качество образцов проверяли, используя электрофорез в агароз-ном геле [17].
ПЦР-амплификация и клонирование гена ами-ломальтазы. Первый комплект вырожденных праймеров: прямой праймер EF-1, 5'-TGC-CGCGCWGGCGGCGGG-3' и обратный праймер EF-2 5'-TTYAC IYYITCATCGGCRAACAT-3' для мезофильных бактерий; прямой праймер TF-1, 5'-CTYCTSCAYCCCACSAGCCT-3', праймер AMY-F 5'-ATGGAGCTTCCBCGCGCTTW-YGGTCTGC-3' и обратный праймер TR-1 5'-GG-SCKYCCMGGGTAGTTCAT-3', праймер TR-2, 5'-CKIYCCGTGGCCTCSGCCA-3', и праймер AMY-R 5'-YTAVASCCKKYCCGTGGCCTCS-GCC-3' для термофильных бактерий. Эти прай-меры были разработаны на основе N- и С-кон-цевых консервативных последовательностей генов амиломальтазы из мезофильных и термофильных бактерий, депонированых в банке генов. Второй комплект вырожденных праймеров: (AMYsp-F 5'-TGGGGNAAYCCCSTTTACM-
RCTGGGA-3' — прямой праймер и обратный прай-мер AMYsp-R 5'-TCGGGGGTKATVAMVCCYAR-GTCCTC-3') были разработаны для ПЦР в консервативных областях 2 и 4 генов амиломальтазы.
Все продукты ПЦР были клонированы в вектор pGEM®-T Easy, который потом был трансформирован в Е. coli DH5 а. Секвенирование ДНК было выполнено в "Bio Service Unit" (National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Таиланд). Для экспрессии полученный ген амиломальтазы был амплифицирован с использованием прямого праймера AMYp13 5'-GGGAAT-TC CATATG GAGCTTCCCCGCGCTTTCGG-3' и обратного AMYp13 5'-СС GGAATTC CTA-GAGCCGTTCCGTGGCCTCGGCC- 3', содержащего Nde I и Eco RI сайты рестрикции. Условия ПЦР были следующими: преденатурация ДНК при 95°С 5 мин и 30 циклов денатурации при 95°С в течение 1 мин, отжиг при 57°С в течение 0.5 мин, при 72°С в течение 1.5 мин с последующей элонгацией при 72°С 5 мин. Продукт ПЦР расщепляли Nde I и Eco RI и клонировали в Nde I-Eco RI в сайт рестрикции рЕТ-17Ь вектора экспрессии. Полученную плазмиду p17bAMY трансформировали в Е. coli BL21 (DE3) методом теплового шока, согласно инструкции производителя ("New England Biolabs", США). Наличие вставки гена было подтверждено путем проверки рестрикции, секвенирования ДНК и измерением амиломаль-тазной активности.
Экспрессия и очистка гена амиломальтазы. Ре-
комбинантные клетки P17bAMY культивировали в LB-среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, на шейкере при 250 об./мин и 37°С. По достижении OD600 культуральной среды значения
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.