МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 2, с. 258-266
ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.151.35:577.152.27
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК-ЛИГАЗ ТЕРМОФИЛЬНЫХ АРХЕЕВ Pyrococcus abyssi И Methanobacterium thermoautotrophicum
© 2011 г. А. И. Закабунин*, Т. П. Камынина, С. Н. Ходырева, И. А. Пышная, Д. В. Пышный, Е. А. Храпов, М. Л. Филипенко
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 25.06.2010 г. Принята к печати 31.08.2010 г.
Гены ДНК-лигаз термостабильных археев Pyrococcus abyssi ^¿ДН^ли^Ь!) и Methanobacterium thermoautotrophicum (MthДНК-лигазы) клонированы в клетках Escherichia coli. Исследована активность очищенных ферментов в реакции лигирования смеси двух олигонуклеотидов, один из которых содержит пре-формированную шпилечную структуру. Максимальный выход продуктов реакции под действием обеих ДНК-лигаз наблюдали вблизи 70°С; при стехиометрическом отношении фермента к субстрату выход продукта достигает плато на уровне 70—75%. Исследованные ДНК-лигазы различаются по термостабильности. Время полуинактивации iйbДНК-лигазы при 90°С составляет около 60 мин. МйДНК-лигаза при этой температуре полностью инактивируется в течение 10 мин. Рекомбинантные ДНК-лигазы P. abyssi и M. thermoautotrophicum стабильны и могут длительно хранится при 4°С.
Ключевые слова: PabДНК-лигаза, М^ДНК-лигаза, аденилирование, шпилечный ДНК-дуплекс, термостабильность .
CLONING OF GENES, PURIFICATION AND PROPERTIES INVESTIGATION OF RECOMBINANT DNA LIGASES FROM THE THERMOPHILIC ARCHAEON Pyrococcus abyssi and Methanobacterium thermoautotrophicum, by A. I. Zakabunin*, T. P. Kamynina, S. N. Khodyreva, I. A. Pyshnaya, D. V. Pyshnyi, E. A. Khrapov, M. L. Filipenko (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090 Russia; *e-mail: zakab@ngs.ru). The genes encoding of DNA ligases from the thermophilic archaeon Pyrococcus abyssi (PabDNA ligase) and Methanobacterium thermoautotrophicum (MthDNA ligase) were cloned and expressed in Escherichia coli. The activity of purified enzymes was studied by ligation of two oligonucleotides, one of which had preformed hairpin structure. In the used system the maximal output of reaction products for both DNA ligases was observed near 70°C that is explained by substrate thermostability. At stoichiometric ratio of enzymes and substrate the output of a product reaches of plateau at 70—75% of theoretical ones. Investigated DNA ligases showed different thermostability. The half-time life of Pab DNA ligase was about 60 min at 90°C. MthDNA ligase was completely inactivated at this temperature during 10 min. Recombinant DNA ligases from P. abyssi and M. thermoautotrophicum possesed high stability during a storage at 4°C.
Keywords: Pab DNA ligase, MthDNA ligase, adenylation, hairpin DNA duplex, thermostability.
Из ферментов термофильных и гипертермофильных организмов, растущих при температурах 45—80°С и выше 80°С соответственно, большое внимание привлекают ферменты обмена нуклеиновых кислот, в том числе ДНК-лигазы. Эта группа играет важную роль в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК во
всех трех царствах живых организмов [1]. Начиная с 1988 г., когда было предложено использовать лигирование олигонуклеотидов, гибридизо-ванных встык на ДНК-матрице [2], для обнаружения однонуклеотидных замен в области контакта, получили большое развитие методы LDR (Ligase Detection Reaction).
Принятые сокращения: БСА — бычий сывороточный альбумин; ДТТ — дитиотреит; ИПТГ — изопропил-Р^-тиогалакто-пиранозид; ПААГ — полиакриламидный гель; п.н. — пара нуклеотидов; ПЦР — полимеразная цепная реакция; ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота; CBB G-250 (Coumassi Bright Blue) — кумасси ярко-голубой G-250; LDR (Ligase Detection Reaction) — определение лигазной реакции.
* Эл. почта: zakab@ngs.ru
Ферменты, выделенные из термофильных бактерий, часто и успешно применяются для катализа лигазных цепных реакций, и некоторые из них коммерчески доступны [Taq ("New England Biolabs"), Tth ("Advanced Biotechnologies Ltd")]. Однако сравнительные исследования активности ДНК-лигаз при использовании единой методики показали, что даже близкородственные ферменты могут значительно отличаться по эффективности лигирования в оптимальных условиях, и эти различия связаны со структурой и свойствами ДНК-лигаз, а не с присутствием ингибиторов в препаратах ферментов. Так, ДНК-лигазы, выделенные из термофильных микроорганизмов Thermus scotoductus (Ts), Th. hemophilus (Tth), Th. aquaticus (Taq) и Rhodothermus marinus (Rm) по скорости и степени лигирования располагаются в ряду: Ts > Rm > Tth > Taq [3]. Поэтому поиски новых термостабильных ДНК-лигаз сохраняют свою актуальность. Особенно интересны ДНК-лигазы гипертермофильных архей, в том числе — представителей рода Pyrococcus, которые исследуются как на геномном [4, 5] и физиологическом [6] уровнях, так и на уровне отдельных генов и белков, в том числе и ДНК-лигаз. Описаны выделение и свойства ДНК-лигаз из P. horikoshii [7], P. furiosus [8—12], проведены кристаллографические исследования ДНК-лигазы P. furiosus [10, 11].
Облигатный барофил P. abyssi, впервые описанный в 1993 г. [13], способен расти при температуре, достигающей 102°С. Расшифрован геном P. abyssi (Pyrococcus abyssi Home page at Genoscope; ht-tp://www.genoscope.cns.fr/Pab/); предсказана локализация генов различных белков в геноме, включая ген ДНК-лигазы (GenBank AL096836). Однако работы по клонированию гена, выделению и биохимическому изучению фермента пока не опубликованы, хотя имеется ссылка на неопубликованные данные [14] о способности ДНК-лигазы P. abyssi использовать в качестве кофактора как ATP, так и NAD+.
Цель настоящего исследования — клонировать ген ДНК-лигазы глубоководного архея Pyrococcus abyssi GE5, выделить рекомбинантный белок и исследовать его активность. Для сравнительного изучения активности и точности лигирования ников нами также клонирован ген термофильной ДНК-лигазы из архея Methanobacterium thermoautotrophi-cum (МйДНК-лигазы), выделен и охарактеризован этот фермент [15].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Использовали эндонуклеазы рестрикции EcoRI, BamHI, SalGI, Sfr274I (изошизомер Xhol) и PspEI (изошизомер BstEII) производства НПО "СибЭн-зим" (Новосибирск), Т4-полинуклеотидкиназу и Т4-ДНК-лигазу ("Биосан", Новосибирск), полиме-разу под кодовым названием KOD Hot Start DNA Poly-
merase ("Novagen", США), [a-32P]ATP и [y-32P]ATP (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск), налидиксовую кислоту ("Fluka", Германия), ИПТГ ("Хеликон", Россия), кумасси ярко-голубой G-250 (CBB G-250), среду LB ("Sigma"). ДНК штамма P. abyssi GE5 получена из Института Пастера (Франция). Штамм M. thermoautotrophicum АН любезно предоставлен К.С. Лауринавичюс (ИБФМ РАН, Пущино).
Ферменты очищали на хроматографе BioLogic LP ("Bio-Rad", США) с использованием сорбентов Macro-Prep DEAE, Macro-Prep High S и BioGel P2 производства "Bio-Rad"), Ni-хелатной сефарозы, гепарин-сефарозы и Q-сефарозы ("GE Healthcare", Швеция).
Олигонуклеотиды N (5'-pGCAGTCACAGAG-CAGTCGTCGCACGCACGG-3') и M (5'-CCGTGCGTGCGACGACTGCTCTGTGACTGCG AGGGCGACTCGACGATTTTTCGTCGAGTCGC-CCT-3'), LIGP1 (5'-GTTGGATCCAGGTACATA-GAGCTGGCC- 3'), LIGP2 (5'-CCAGTCGACAC-CTTTCCCTTCATCCT-3'), LigMth 1 (5'-ATGAAG-GAATTGCTCTATATGG-3'), LigMth 2 (5'-ACCT-GGTTGGTCTGG-3'), Lig-rMth 3 (5'-CGGGCA-GAATTCA-TGAAGGAATTGCTCTATATGG- 3') и Lig-rMth 4 (5'-ACCTGGTTGGTCTGG-3') синтезировали фосфитамидным методом на ДНК-синтезаторе "ASM-800" ("Биоссет", Новосибирск), используя мономерные синтоны ("Glen Research", США).
Концентрацию олигонуклеотидов определяли на спектрофотометре UV-2100 ("Shimadzu", Япония), используя суммарные величины молярных коэффициентов поглощения моно- и динуклеоти-дов при длине волны 260 нм [16].
Термическую денатурацию комплексов олигонук-леотидов исследовали при суммарной концентрации стехиометрической смеси взаимодействующих олигонуклеотидов, равной 2 мкМ, в смеси 10 мМ какодилата натрия (pH 7.3), 15 мМ NaCl 10 мМ MgCl2 [17] на спектрофотометре "Cary 300 BioMelt" ("Virian", Австралия) с термостатируемыми кюветами.
[5'-32Р]-меченые олигонуклеотиды получали, используя [y-32P]ATP по методу, описанному ранее [18].
Конструирование плазмиды и получение продуцента РаЬДНК-лигазы. Фрагмент кодирующей области гена ДНК-лигазы (1680 п.н.) получали посредством ПЦР на геномной ДНК P. abussi GE5 с олигонуклеотидными праймерами LIGP1 и LIGP2. После гидролиза полученного фрагмента эндо-нуклеазами BamHI и SalGI его лигировали с плаз-мидным вектором pET23a(+), гидролизованным BamHI и Xhol. Плазмиды (pET-lig) клонов, отобранных по результатам рестрикционного анализа, для подтверждения структуры вставки секвениро-вали методом Сенгера с использованием наборов BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.1 ('Applied Biosystems", США) на генетическом анализаторе
"ABI PRISM 3100" ('Applied Biosystems", США) по протоколам производителя. Синтез рекомбинант-ного белка индуцировали в соответствии с рекомендациями по использованию плазмид семейства pET ("Novagen", USA). Трансформированные плазми-дой pET-lig клетки E. coli BL21(DE3) выращивали в 1 л среды LB при 37°С в присутствии ампициллина (100 мкг/мл) до оптической плотности 0.6—0.8 при 600 нм. В среду вносили ИПТГ до конечной концентрации 0.4 мМ и продолжали культивировать в течение 3 ч. Клетки собирали центрифугированием и хранили при —80°С.
Выделение рекомбинантной РаДДНК-лигазы.
Биомассу разрушали по описанному методу [19]. К 3 г замороженной биомассы добавляли 25 мл буфера, содержащего 50 мМ Na-фосфат, рН 7.0, 50 мМ Д-глюкозу, 1 мМ ЭДТА. Суспензию перемешивали до гомогенного состояния, затем проводили два цикла замораживания при —80°С (в течение часа) и размораживали на водяной бане при 70°С. После центрифугирования осветленный экстракт наносили на колонку с Macro-Prep DEAE (2.4 х 8.5 см), уравновешенную 50 мМ Трис-HCl, рН 7.0. Белок элюировали линейным градиентом NaCl (от
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.