МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 802-809
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.11.082.261+577.152.1
КЛОНИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНА КАТЕХОЛ-2,Э-ДИОКСИГЕНАЗЫ, ЛОКАЛИЗОВАННОГО В ХРОМОСОМЕ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ZD 4-3
© 2004 г. И.-К. Чен*'1, X. Лиу*, Л.-Ч. Жу**, И.-Ф. Жин**
*Кафедра инженерии окружающей среды, Университет Чжэцзян, Ханчжоу, Китай **Институт биохимии, Университет Чжэцзян, Ханчжоу, Китай Поступила в редакцию 21.04.02 г.
Катехол-2,3-диоксигеназа (C23O), одна из диоксигеназ экстрадиолового типа, расщепляющих в ди-гидроксилированных ароматических субстратах ароматическую C-C-связь в мета-положении, катализирует превращение катехола в полуальдегид 2-гидроксимуконовой кислоты. На основании экспериментов с элиминацией плазмид, идентификации с помощью ПЦР и гибридизации по Саузер-ну ген, кодирующий C23O у штамма Pseudomonas aeruginosa ZD 4-3, расщепляющего моно- и бицик-лические соединения по мета-пути, был локализован в рестрикционном (EcoRI/5amHI) фрагменте размером около 3.5 т.п.о. и клонирован. Определение полной нуклеотидной последовательности гена C23O выявило одну открытую рамку считывания с высокой степенью сходства аминокислотной последовательности с последовательностями, известными для C23O мезофильных грамотрицатель-ных бактерий. Анализ выравнивания показал наличие отчетливых различий между C23O исследованной в данной работе и 2,3-дигидроксибифенилдиоксигеназами, расщепляющими бициклические ароматические соединения. После гетерогенной экспрессии гена pheB в E. coli BL21(DE3) клонированная C23O сохраняла способность катализировать мета-расщепление.
Ключевые слова: катехол-2,3-диоксигеназа, клонирование, экспрессия, мета-расщепление, ген pheB.
Ароматические соединения, широко используемые в промышленности и сельском хозяйстве, попадают в окружающую среду; в Китае это становится все более серьезной проблемой. Многие из этих соединений весьма устойчивы или токсичны, и поэтому разрабатываются методы ограничения или ликвидации их присутствия в окружающей среде, в том числе методы биоремедиации с использованием почвенных микроорганизмов [1, 2].
Выделено немало бактериальных штаммов, способных к разложению и использованию ароматических соединений. Для ряда грамотрица-тельных почвенных бактерий соответствующие катаболические пути расшифрованы на биохимическом уровне и даже на уровне молекулярной генетики [3]. Большинство ароматических соединений подвергаются аэробной деградации через общий промежуточный продукт (катехол или протокатехат, в зависимости от структуры исходного соединения). Дальнейшее разложение катехола происходит путем расщепления либо C-C-связи между гидроксилированными атомами, либо связи, прилегающей к гидроксилированному атому (жета-расщепление, осуществляемое 2,3-диокси-геназами [4, 5]). Катехолдиоксигеназы являются ключевыми ферментами бактериального разло-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: yxchen@zju.edu.cn).
жения многих ароматических соединений. Реакции, катализируемые этими ферментами, определяют скорость разложения ряда ароматических соединений, например пара-ксилол/пара-толуат и хлортолуол/хлорбензоат [6].
Ранее мы выделили две бактерии, Pseudomonas aeruginosa ZD 4-3 и Comamonas testosteroni ZD 4-1, разлагающие ароматические соединения. Было показано, что они обладали, соответственно, мета- и орто-путями расщепления. Что касается деградаци-онных свойств, то штамм ZD 4-1 обладал более широким спектром разлагаемых соединений и лучше адаптировался к флуктуациям pH. Однако мета-путь расщепления штамма ZD 4-3 был явно более эффективен, чем орто-путь штамма ZD 4-1, по-видимому, в значительной степени благодаря более высокой активности C23O по сравнению с C12O.
В ходе настоящего исследования с целью характеристики биохимических и генетических свойств диоксигеназ экстрадиолового типа ген C23O был клонирован и экспрессирован в Escherichia coli. Были проанализированы нуклеотидная последовательность гена и аминокислотная последовательность белка, полученная путем концептуальной трансляции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы, условия культивиро-ваеия, плазмиды. Pseudomonas aeruginosa ZD 4-3, выделенный в нашей лаборатории, растили при 30°C на минеральной среде с 250 мг/л фенола в качестве источника углерода, как описано ранее [7]. Штаммы E. coli TG1 и BL21(DE3) выращивали на среде LB при 37°C. Использовали клонирующий вектор pGEM-T easy ("Promega", США) и экспрес-сионный вектор pET2-2b(+) ("Novagen", США). Для селекцции плазмид использовали ампициллин в концентрации 100 мг/мл.
Манипуляции с ДНК. Выделение плазмид, обработку рестриктазами, лигирование ДНК и гель-электрофорез проводили стандартными методами [8]. Для гибридизации по Саузерну, хромосомную ДНК P. aeruginosa ZD 4-3 выделяли, используя набор для выделения тотальной ДНК (Total DNA Isolation Kit, "Promega", USA) согласно рекомендациям производителя. Гибридизацию по Саузерну проводили согласно руководству пользователя dIG-системой (DIG System User's Guide, Roche Molecular Biochemicals, Germany). Для гибридизации использовали меченный дигоксигенином фрагмент, полученный с помощью ПЦР.
Элиминацию плазмид проводили методом, описанным Fujii с соавт. [9].
Клонирование гена pheB из P. aeruginosa ZD 4-3
проводили, используя стандартные методы молекулярного клонирования [8, 12]. На основании консервативных концевых последовательностей известных генов C23O из Pseudomonas sp. была подобрана пара праймеров для ПЦР (прямой праймер 5'-GGCCA TGGTC ATGAA CAAAG GTGTA ATGCG-3' и обратный праймер 5'-GGGAA TTCTC AGGTC AGCAC GGTCA TGAA-3'). В указанных праймерах подчеркнутые нуклеотидные последовательности являются сайтами рестрикции для эндонуклеаз NcoI и EcoRI соответственно. Для амплификации гена pheB в качестве матрицы использовали тотальную ДНК штамма ZD 4-3. Реакционная смесь для ПЦР (конечный объем 50 мкл) содержала 10х буфер для ПЦР, 5 мкл; 25 мМ MgCl2, 4 мкл; 5 мМ dNTP, 2 мкл; 20 мкМ прайме-ры, 1 мкл каждого; ДНК-матрицу, 100 нг; Taq-по-лимеразу (5000 ед/мл), 0.5 мкл; стерильную дисти-лированную воду, 35.5 мкл. Температурный профиль реакции был следующим: 2 мин при 94°C; затем 30 циклов: 1 мин при 94°C, 1 мин при 45°C, 2 мин при 72°C; финальная элонгация в течение 10 мин при 72°C; и охлаждение до 4°C. ПЦР-продукт очищали и лигировали с вектором pGEM-T easy. Наконец, целевой фрагмент обрабатывали рестриктазами NcoI и EcoRI и лигировали с вектором pET-22b (+), обработанным теми же рестрик-тазами.
Экспрессия гена pheB в E. coli. Для экспрессии гена pheB в качестве бактерии-хозяина использовали E. coli BL21(DE3). После получения реком-бинантного вектора (обозначенного pET-LH12), его вводили путем трансформации в E. coli BL21(DE3), и, после 2 ч культивирования, проводили 4-часовую индукцию изопропил-тиогалак-топиранозидом (1 ммоль/л ) для достижения экспрессии гена pheB [11].
Получение свободной от клеток культураль-ной жидкости и клеточного экстракта. Клетки штамма ZD 4-3 и E. coli, содержащие плазмиду pET-LH12, культивировали в среде LB в течение ночи при 30 и 37°C соответственно. Клетки собирали центрифугированием при 12000 об/мин 5 мин, и су-пернатант использовали в качестве свободной от клеток культуральной жидкости для определения ферментативной активности. Осадок клеток промывали фосфатным буфером (PBS), разрушали ультразвуком (99 х 3 с) на льду и центрифугировали при 12000 об/мин 10 мин. Супернатант использовали в качестве клеточного экстракта для определения ферментативной активности.
Определение C23O. Метод определения C23O in vitro описан ранее [7].
Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей. Аминокислотные последовательности, полученные в результате концептуальной трансляции клонированного в данной работе гена pheB, выравнивали с аминокислотными последовательностями других диоксигеназ экстра-диолого типа, обнаруженными в базе данных GenBank. Эти диоксигеназы принадлежали к трем группам: мезофильные C23O, расщепляющие моноциклические ароматические соединения (AY112717, AF320981, AB035539, D85415, AB004065, U93090, U01825); термофильная C23O, расщепляющая моноцикличские ароматические соединения (AF140605) и диоксигеназы, расщепляющие бицик-лические соединения - 2,3-бигидроксидиоксигена-зы (U22355, X97984, X66122, D44550). Для анализа выравнивания использовали программу BioEdit; все параметры имели значения, принимаемые по умолчанию. Для построения филогенетического дерева использовали программу DNAstar.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Данные, свидетельствующие о докализации гена C23O на хромосоме. В эксперименте по элиминации плазмид 95% колоний штамма ZD 4-3, обработанного акридиновым оранжевым, по-прежнему могли расти за счет использования фенола, что указывало на возможную хромосомную локализацию гена C23O. Для дальнейшего прояснения локализации гена C23O хромосомная и плазмидная ДНК штамма ZD 4-3 были экстрагра-гированы и использованы в качестве матрицы
2000 п.о.
1000 п.о. 750 п.о.
500 п.о. 250 п.о. 100 п.о.
12 3 M
Рис. 1. Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР: дорожка 1 - ПЦР проведена на плазмидной ДНК штамма ZD 4-3, реэкстрагированной из E. coli; дорожка 2 - ПЦР-продукт получен на плазмидной ДНК, выделенной непосредственно из штамма ZD 4-3, дорожка 3 - ПЦР-продукт получен на хромосомной ДНК штамма ZD 4-3.
для ПЦР. Кроме того, плазмидная ДНК, экстрагированная из клеток штамма ZD 4-3, использовалась для трансформации E. coli TG1 и затем экстрагировалась из E. coli; таким образом было исключено присутствие в этом препарате плазмидной ДНК примеси хромосомной ДНК штамма ZD 4-3. Как видно из рис. 1, амплификация pheB происходила при использовании в качестве матрицы хромосомной ДНК или плазмидной ДНК, выделенной непосредственно из штамма ZD 4-3, но не плазмидной ДНК реэкстрагированной из E. coli. Эти результаты указывают на вероятную хромосомную локализацию гена C23O. Ложно положительный результат, полученный с плазмидной ДНК, выделенной непосредственно из штамма ZD 4-3, мы объясняем тем, что при проведении экстракции методом щелочного лизиса в препарат плазмидно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.