МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 1, с. 124-132
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21
КЛОНИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ С4 ЧЕРНОГУБОЙ ПИЩУХИ (Ochotona curzoniae) #
© 2014 г. Q.-L. Zhang12, M. Yang2, Y.-Y. Zhao3, S.-Z. Zhang1*, Q.-H. He3*,
X.-Y. Meng3, W.-R. Tan3
department of Medical Genetics, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu,
Sichuan 610041, P.R. China 2School of Laboratory Medicine, Chengdu Medical College, Chengdu, Sichuan 610500 P.R. China 3College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu, Sichuan 610041 P.R. China
Поступила в редакцию 05.05.2013 г. Принята к печати 03.07.2013 г.
Лактатдегидрогеназа С4 (LDH-C4) считается перспективной мишенью для разработки контрацептивных средств. С целью получения родентицида, действие которого направлено на подавление размножения черногубой пищухи (Ochotona curzoniae), клонировали ген LDH-C и экспрессировали его в клетках Escherichia coli. Очистили и охарактеризовали рекомбинантный белок. кДНК гена LDH-Cпищухи клонировали методом RACE. кДНК размером 1488 п.н. содержит открытую рамку считывания (ORF) из 996 п.н., которая кодирует полипептид из 332 аминокислотных остатков. ORF LDH-C пищухи, не содержащую дополнительных тэгов (меток), ввели в клетки E. coli и экспрессировали в них. Рекомбинантный белок LDH-C4 очистили путем нагревания, аффинной и ионообменной хроматографии. Рекомби-нантная LDH-C4 пищухи — это тетрамер с молекулярной массой 140 кДа, стабильный при температуре до 60°C и обладающий температурозависимой каталитической активностью. Оптимум рН прямой и обратной реакции — 7.48 и 10.28 соответственно. Кажущаяся константа Михаэлиса для пирувата и лак-тата равна 51.2 ± 3.8 и 8568.8 ± 409 мкМ соответственно. Константа ингибирования для щавелевой кислоты — 11.8 ± 3.5 мМ. В представленной работе созданы прочные основы для получения контрацептивного родентицида, действие которого направлено на LDH-C4 пищухи.
Ключевые слова: Ochotona curzoniae, экспрессия в E. coli, лактатдегидрогеназа С4, ферментативная кинетика, клонирование кДНК.
CLONING AND CHARACTERIZATION OF LACTATE DEHYDROGENASE C4 FROM PIKA Ochotona curzoniae, by Q.-L. Zhang1'2, M. Yang2, Y.-Y. Zhao3, S.-Z. Zhang1*, Q.-H. He3*, X.-Y. Meng3, W.-R. Tan2 ^Department of Medical Genetics, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan 610041, P. R. China; *e-mail: qinghua_he@swun.cn; 2 School of Laboratory Medicine, Chengdu Medical College, Chengdu, Sichuan 610500 P.R. China; 3College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu, Sichuan 610041 P.R. China). Lactate dehydrogenase C4 (LDH-C4) is considered to be a good target protein for the development of contraceptive drugs. To develop contraceptive rodenticide against pika (Ochotona curzoniae) LDH-C4, the pika LDH-C gene was cloned and expressed in Escherichia coli. The recombinant protein was purified and characterized. The cDNA of pika lDH-C gene was cloned by RACE method. The cDNA was 1498 bp in length containing an ORF of 996 bp which encoded a polypeptide of 332 amino acids. The ORF of pika LDH-C was introduced in E. coli and expressed with no fusion tags added. The recombinant LDH-C4 protein was purified by heating, affinity chromatography and ion-exchange chromatography. The recombinant pika LDH-C4 was a tetramer with a molecular weight of approximately 140 kDa, and it had temperature-dependent catalytic activity, as it was thermally stable up to 60°C. The optimal pH values in the forward and backward reactions were around 7.48 and 10.28, respectively. The apparent Michaelis constants for pyruvate and lactate were 51.2 ± 3.8 and 8568.8 ± 409 ^M respectively. The inhibition constant for oxalic acid was 11.8 ± 3.5 mM. This study laid a solid foundation for contraceptive rodenticide development against pika LDH-C4.
Keywords: Ochotona curzoniae, E. coli expression, LDH-C4, enzyme kinetics, cDNA cloning. DOI: 10.7868/S0026898414010170
# Текст представлен авторами на английском языке.
* Эл. почта: qinghua_he@swun.cn
Черногубая пищуха (Ochotona curzoniae) — вид млекопитающих семейства Ochotonidae. Пищухи обитают в горах на высоте 3100—5000 м, преимущественно на Тибетском плато [1]. За последние годы частые вспышки массового размножения грызунов, среди которых преобладает черногубая пищуха, стали важным фактором деградации горных лугов на плато [2].
Лактатдегидрогеназа (LDH; [КФ 1.1.1.27]) — олигомерный фермент, который действует в конце гликолитического пути. LDH может специфически катализировать окислительно-восстановительную реакцию между пировиноградной и молочной кислотами [3]. У млекопитающих известны три изофермента LDH: LDH-A, LDH-B и LDH-C [4]. LDH-C — тканеспецифичная форма, обнаруженная только в зрелых семенниках и сперме, причем в этих тканях найдена только одна форма LDH-C — LDH-C4 [5]. Тканеспецифиче-ское распределение LDH-C привлекает внимание ученых с 1970-х годов. LDH-C4, как полагают, участвует в энергетическом метаболизме спермиев, поскольку этот изозим обнаружен в зрелой сперме млекопитающих, а LDH — входит в число ферментов гликолитического пути [6].
LDH-C считается лучшей мишенью для имму-ноконтрацепции [7]. Начиная с 1980-х ведутся работы по конструированию иммуноконтрацептив-ных вакцин на основе LDH-C4. LDH-C4 используют в качестве антигена для получения антител, подавляющих репродукцию многих млекопитающих [8, 9]. ДНК-вакцины на основе LDH-C могут эффективно снижать плодовитость крыс [10]. В июле 2008 г. Goldberg и соавт. показали, что нокаут гена LDH-C, кодирующего белок LDH-C4, существенно снижает репродуктивные функции самцов мышей [11]. Эти результаты еще раз подтверждают существование прямой связи между LDH-C и фертильностью самцов. Таким образом, LDH-C4 может служить белковой мишенью для разрабатываемых контрацептивных средств.
Чтобы получить белок LDH-C4 в количестве, достаточном для проведения скрининга малых молекул in vitro, мы клонировали ген LDH-C чер-ногубой пищухи и экспрессировали его в клетках Escherichia coli, очистили и охарактеризовали ре-комбинантный белок. Эта работа создает прочный фундамент для разработки контрацептивного родентицида, действие которого направлено на LDH-C4 пищухи.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Mатериалы. Черногубых пищух отлавливали на альпийских лугах на высоте 4015 м на границе округа Aba провинции Sichuan и провинции Qing-hai. Животных отлавливали, используя ловушки для крыс и липкие доски, и немедленно препари-
ровали. Ткани семенников помещали в раствор для хранения образцов до выделения РНК в Chengdu. Раствор для хранения образцов получен из "Taitianhe Bio-Technology Co. Ltd." (Китай). Набор обратной транскриптазы (TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver. 3.0), вектор PMD18-T, набор для 3'-RACE и секвенирующие праймеры Bca-BESTTM RV-M и M13-47 предоставлены фирмой "TaKaRa" (Китай). Реагент Trizol получен от "In-vitrogen Corp." (Китай). Штамм BL21 E. coli использовали в качестве хозяйского для получения всех плазмид. Штамм BL21 (DE3) E. coli использовали для продукции белка LDH-C4. Плазмида pET-32a (промотор T7 с ^^таратором и T7-тер-минатором) "Novagen" (Китай) служила вектором экспрессии. Голубую сефарозу и Superdex 200 получили от "GE Healthcare" (Китай), DEAE-се-фарозу — от "Sigma" (США). Преупакованные градиентные гели (4—15%) предоставлены фирмой "Bio-Rad" (США).
Клонирование кДНК гена лактатдегидрогена-зы С пищухи. Черногубая пищуха (O. curzoniae) принадлежит к семейству Ochotonidae отряда Lagomorpha. Нуклеотидные последовательности генов LDH-C других представителей отряда Lago-morpha не найдены нами в GenBank. В связи с этим мы выбрали стратегию клонирования экс-прессирующихся последовательностей (EST) гена LDH-C сначала с использованием вырожденных праймеров. Остальную часть кДНК клонировали методом RACE. Прямой праймер содержал стартовый код он, поэтому полная ORF была легко клонирована с использованием метода 3'-RACE. Нами сконструированы три вырожденных праймера: D-Ps (5'-ATGTCMACYGTCAAG-GAGCAGCT-3', стартовый ATG-кодон подчеркнут); D-Pa1 (5'- GCAGAYACABTGTAATCT-TTTCC-3') и D-Pa2 (5'-TTACARCCACTTCCRATY-AC-3'). Сайты, к которым специфичны сконструированные праймеры, показаны на рис. 1.
Суммарную РНК выделяли с использованием Trizol из 0.5 г ткани семенников черногубой пищухи в соответствии с инструкциями производителя. кДНК синтезировали из 1.0 мкг суммарной РНК согласно инструкциям к набору обратной транскриптазы ("TaKaRa"). кДНК служила матрицей для клонирования EST методом гнездной ПЦР. В первом раунде ПЦР использовали праймеры D-Ps и D-Pa2. Матрицей во втором раунде ПЦР с праймерами D-Ps и D-Pa1 служили 0.5 мкл ПЦР-продукта первого раунда.
После клонирования EST и определения нук-леотидной последовательности подобраны два ген-специфичных праймера: Pika-Ps1 (5'-CT-TGCCCTTGTTGATGTTGCAGA-3') и Pika-Ps2 (5' - GGATCTTCAACATGGCAGTCT- 3'). 3'-Кон-цевую область кДНК LDH-C клонировали методом 3'-RACE с двумя ген-специфичными прай-
D-Ps
Bos
Sus
Hom
Pan
Mac
Cri
Mus
Rat
gtcaaggagcägct
gtcaaggagcagct
gtcaaggagcägct
gtcaaggagcagct
gtcaaggagcägct
gtcaaggagcagct
50
GAGggAgETGg сяДгШ; "О ОАбДтДгбД
GAG®T®TAg
саашаштай сссЙваЙВтаи
ссаНЗтВНадй
226
D-Pa1
275
Bos Sus Hom Pan Mac Cri Mus Rat
tctgc
tctgc
tctgc
tctgc
tctgc
446
D-Pa2
495
Bos Едйт! taag тНЯтт
Sus Цг1 TiaacT
Hom TggCT
Pan Ща тНЭст
Mac taag тНЯст
Cri ¡2Е taag тНЯсс
Mus IagS taag sggH
Rat Iagb taag ц ж
gcgactc |gcgactc| gt0actc|
Igt^actcI
tgactc igc0actc 3t0ggcc gthagca
Рис. 1. Сайты, использованные для конструирования вырожденных праймеров. Участки, которым соответствуют вырожденные праймеры D-Ps, D-Pa1 и D-Pa2, отмечены пунктиром. Bos, Sus, Hom, Pan, Mac, Cri, Mus и Rat — Bos taurus (BC105361.1), Sus scrofa (U95378.1), Homo sapiens (NM_002301.4), Pan troglodytes (XM_508318.2), Macaca fascicularis (AB169182.1), Cricetinae gen. sp. (AF070995.1), Mus musculus (NM_013580.4) и Rattus norvegicus (NM_01
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.