МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 5, с. 785-789
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.321
КЛОНИРОВАНИЕ кДНК, ЭКСПРЕССИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ СЕЛЕНСОДЕРЖАЩЕГО БЕЛКА МЫШИ SelV (SELENOPROTEIN V)
© 2015 г. Е. Г. Варламова*, С. В. Новосёлов, В. И. Новосёлов
Институт биофизики клетки Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290
Поступила в редакцию 07.10.2014 г. Принята к печати 25.12.2014 г.
К настоящему времени с помощью биоинформатических подходов идентифицировано 25 селенопроте-инов млекопитающих, получивших свое название благодаря присутствию в них аминокислоты селено-цистеина (Sec). Функционально охарактеризованные селенсодержащие белки относятся к оксидоре-дуктазам с различными функциями, в том числе к глутатионпероксидазам, тиоредоксинредуктазам, дейодиназам. Однако функции более половины из идентифицированных селенопротеинов не установлены, включая белок V млекопитающих (Selenoprotein^ SelV). Нами изучено изменение уровня экспрессии мРНК гена selV в семенниках мыши в процессе постнатального развития. Экспрессия мРНК selV выявляется в семенниках на протяжении всего постнатального развития мышей, достигает максимального уровня в период полового созревания и постепенно снижается у взрослых особей (8—18 мес). Мы попытались приблизиться к пониманию функций SelV, определив субстратную специфичность и ферментативную активность этого белка. Оказалось, что SelV обладает и глутатионпероксидазной, и тио-редоксинредуктазной активностью.
Ключевые слова: селеноцистеин, цистеин, селенопротеины, оксидоредуктазы.
cDNA CLONING, EXPRESSION AND DETERMINATION OF SUBSTRATE SPECIFICITY OF MICE SELENOCYSTEINE-CONTAINING PROTEIN SelV (SELENOPROTEIN V), by E. G. Varlamova*, S. V. Novoselov, V. I. Novoselov (Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia; *e-mail: admin@icb.psn.ru). To date various bioinformatic tools allowed to identify 25 selenocysteine-containing mammalian proteins. The name of these proteins assumes that they contain the amino acid selenocysteine (Sec). Functionally characterized selenocysteine-containing proteins are oxidoreduc-tases with various functions, including glutathione peroxidases, thioredoxin reductases, deiodinases etc. However, the functions of more than half of identified proteins are still unclear, and mammalian selenoprotein SelV is among them. We studied the selV gene expression in mice testes during postnatal development. We have established the presence of mRNA selV in all stages of postnatal development with the maximum level of mRNA expression during puberty, whereas in adult mice (8—18 months) we observed a gradual decrease of expression. In order to get closer to the functional role of Selenoprotein V, we have carried out experiments on the substrate specificity and enzymatic activity measurement of this selenocysteine-containing protein. It was shown that SelV posseses glutathionperoxidase and thioredoxinreductase activities.
Keywords: selenocysteine, cysteine, selenoproteins, oxidoreductases, protein activity. DOI: 10.7868/S0026898415050183
Важная роль свободных радикалов и активных форм кислорода в процессах жизнедеятельности клетки сегодня не вызывает сомнений. Нарушением внутриклеточных процессов окисления-восстановления часто сопровождается развитие таких распространенных патологий, как сахарный диабет, инфаркт миокарда, нейродегенеративные, бронхо-легочные, онкологические заболевания и др.
К настоящему времени описано большое количество ферментов-антиоксидантов, относя-
щихся к различным системам редокс-биологии, среди которых ключевая роль принадлежит членам суперсемейства тиоловых оксидоредуктаз. В состав этого суперсемейства входят тиоредокси-ны и глутаредоксины, пероксиредоксины, проте-индисульфидизомеразы, глутатионпероксидазы и ряд других белков. В дополнение к антиокси-дантной функции тиоловые оксидоредуктазы обладают способностью к утилизации пероксида водорода для образования специфичных дисуль-
Принятые сокращения: SelV — селенсодержащий белок V; DTNB — 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная)кислота; TNB — 5-тио-2-нитробензойная кислота.
* Эл. почта:19281у@ша11.ги
6
785
786
ВАРЛАМОВА и др.
фидных связей внутри и между белками, что существенно расширяет спектр их функциональных возможностей. Поэтому биохимическая характеристика и выяснение механизмов действия белков данного суперсемейства представляют крайне актуальную проблему редокс-биологии. Функционально охарактеризованные селенопро-теины также относятся к оксидоредуктазам с различными функциями. Свое название они получили благодаря тому, что в их состав входит аминокислота селеноцистеин (Sec), которая содержит селен вместо серы, чем отличается от цистеина. Присутствие Sec делает такие белки в 100, а иногда и 1000 раз более реакционноспособными (pKa свободного Cys при нейтральных значениях pH составляет 8.18, а Cys — 5.73). Кроме того, нуклеофиль-ность (или нуклеофильная активность), которая определяется величиной pKa, поляризуемостью, электроотрицательностью и атомным радиусом, у селена выше, чем у серы [1, 2]. К настоящему времени с помощью биоинформатических подходов идентифицировано 25 селенсодержащих белков млекопитающих, однако функции более половины из них не известны [3]. К числу таких селенопротеинов относится и белок SelV млекопитающих.
Экспрессию мРНК восьми из 25 известных к настоящему времени селенсодержащих белков млекопитающих ранее обнаружили в семенниках, причем три белка, GPx4, TGR и SelV, локализуются исключительно в этом органе. Результаты in situ гибридизации [4, 5] показали, что GPx4 экс-прессируется преимущественно на поздних стадиях сперматогенеза, в сперматидах, однако активность этого фермента сложно обнаружить в зрелых сперматозоидах [6, 7].
Белок TGR (тиоредоксинглутаредоксинредук-таза), изофермент тиоредоксинредуктазы, по своей структуре схож с другими изоформами (TrxR1 и TrxR3), но имеет дополнительный мо-нотиоловый глутаредоксиновый домен (Grx) на N-конце. Этот белок экспрессируется преимущественно в семенниках и ранних сперматидах. Предполагается, что он участвует в окислительно—восстановительных реакциях в процессе созревания сперматозоидов [8—10]. Не исключена возможность участия тиоредоксинредуктазы в формировании и сохранении целостности структурных компонентов, необходимых для функционирования клеток Лейдига [11].
Однако информация о роли SelV в данном органе к настоящему времени практически отсутствует. Методом in situ гибридизации показано, что SelV локализуется в семенных пузырьках [3]. Нами изучены изменения уровня мРНК гена selV мыши в семенниках в процессе постнатального развития, а также определена субстратная специфичность и ферментативная активность SelV.
В настоящей работе мы использовали цистеи-новый гомолог белка SelV мыши, полученный путем замены триплета TGA, кодирующего Sec, на TGT, кодирующий Cys. Необходимость в данной замене обусловлена особенностями механизма встраивания Sec в синтезируемые белки. Эта аминокислота кодируется стоп-кодоном TGA, поэтому для распознания этого кодона как селеноцистеино-вого и предотвращения преждевременной термина-ции трансляции существует сложный механизм встраивания Sec в белки, в котором участвуют определенные цис- и транс-активные факторы. Основные из них — элемент SECIS (вторичная структура, располагающаяся у эукариот в З'-нетранслируемой области мРНК, у прокариот — внутри открытой рамки считывания сразу за TGA, что и обуславливает принципиальное различие в механизмах встраивания Sec в этих двух доменах жизни), специфическая тРНК, SECIS-связывающий белок SBP2 и ряд других [12].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Животные. В опытах использовали самцов мышей инбредной линии C57BI/6 следующих возрастных групп: 1, 2, 3 и 4 недель, 2, 8, 12, 18 мес. Животных содержали в стандартных условиях. В опыте использовали по три животных каждой возрастной группы, мышей умерщвляли путем декапитации. Все процедуры выполняли в соответствии с международными правилами обращения с животными.
Выделение нуклеиновых кислот. Суммарную РНК выделяли из семенников мышей с помощью реагента TRIzol® Reagent("Invitrogen", США) согласно протоколу, предложенному фирмой-производителем. Выделение плазмидной ДНК и очистку ПЦР-фрагментов ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью наборов реагентов и по протоколу фирмы ("Евроген", Литва).
Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени. Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью набора реактивов, содержащих ревертазу MMLV ("Евроген"). Реакционная смесь содержала 1 мкг суммарной РНК, амплификацию кДНК проводили с помощью oлигл(dT)-праймеров.
Уровень мРНК гена mselv в семенниках мыши определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBRGreen ("Евроген") и прямого и обратного праймеров (Fselv и Rselv), последовательности которых приведены в таблице. Количество суммарной РНК (1 мкг), используемое в реакциях обратной транскрипции, контролировали, проводя параллельно реакции амплификации с использованием праймеров Fact и Ract, специфичных к гену ß-актина мыши. Нуклеотидная последовательность кДНК гена selV взята из NCBI GenBank (Mus musculus cDNA sequence BC089491) (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
Для каждого образца проводили по три ПЦР в реальном времени, относительный уровень экспрессии (ОУЭ) определяли по формуле: ОУЭ = = 2-АСт, где ДСт — разница между значениями пороговых циклов для референсного (ген Р-актина мыши) и целевого (mselv) генов.
Клонирование и сайт-направленный мутагенез.
Для встраивания открытой рамки считывания гена mselV в вектор pET23b ("Novagen", США) ПЦР-фрагменты амплифицировали с помощью праймеров F1se1V и R1se1V, после чего обрабатывали рестриктазами NdeI и XhoI ("Fermentas", Литва) соответственно. Реакцию лигирования выполняли, используя Т4-ДНК-лигазу ("Fermentas"), при комнатной температуре в течение 1 ч. Сайт-направленный мутагенез, приводящий к замене кодона TGA (Sec) на TGT (Cys), проводили с использованием набора реактивов Quick Change Kit
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.