МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 5, с. 616-619
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
КЛЮЧЕВАЯ РОЛЬ ¿са-ГЕНОВ В КАТАБОЛИЗМЕ едо/ои-КАПРОЛАКТАМА У БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS © 2015 г. Т. З. Есикова*, О. В. Волкова*, С. А. Таран**, А. М. Воронин*
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино
**ООО МБЦ Генериум, Москва Поступила в редакцию 19.02.2015 г.
DOI: 10.7868/S0026365615050079
Исследование молекулярных механизмов возникновения и распространения у микроорганизмов способности окислять чужеродные соединения, ранее не существовавшие в природе, имеет не только научную значимость с точки зрения эволюционной биологии, но и практическое значение для решения задач экологии, биотехнологии и метаболической инженерии.
Капролактам (epsi'lon-капролактам, лактам 6-аминогексановой кислоты, КАП) — один из наиболее востребованных на мировом рынке химических продуктов, ежегодное мировое производство которого исчисляется миллионами тонн. Более 90% произведенного КАП используется для получения полимерных материалов (полика-проамид, капрон, нейлон-6), которые находят широкое применение в различных отраслях народного хозяйства.
Капролактам является устойчивым поллютан-том, оказывающим токсическое воздействие на живые организмы (Gross, 1984). Хотя описаны бактерии, способные использовать его в качестве единственного источника углерода и энергии (Baxi, 2013; Sanuth et al., 2013), бактериальный катаболизм КАП представляет собой малоизученный процесс, на начальных этапах которого участвуют неизвестные гены и ферменты. В результате изучения катаболизма ксенобиотика у штамма-деструктора Pseudomonas dacunhae был предложен биохимический путь его деградации: epsilon-капролактам (КАП) ^ 6-аминогексано-вая кислота (АГК) ^ ^ адипиновая кислота (АД) ^ ^ ^ ^ цикл Кребса (Наумова, 1988). Также было показано, что способность бактерий рода Pseudomonas использовать КАП и его интермедиаты (АГК и АД) в качестве единственных источников углерода и энергии контролируется САР-плазмидами (Наумова, 1988; Есикова и соавт., 1990). Цель настоящей работы — идентификация и исследование молекулярно-ге-нетической организации участков САР-плазми-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: das3534@rambler.ru).
ды pBS270, ответственных за синтез ферментов катаболизма epsilon-капролактама и его интерме-диатов.
В работе использовали штаммы псевдомонад из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН. Объектом исследований служила плазмида биодеградации капролактама pBS270 размером около 110 т.п.н. (Панов и соавт., 2013), обнаруженная в штамме-деструкторе Pseudomonas sp. BS838, выделенном из отходов химического производства (Есикова и соавт., 1990). Штаммы P. putida KT2442(pBS270) и P. vignae 1025(pBS270) были получены путем конъюгацион-ного переноса pBS270 из Pseudomonas sp. BS838. Бактерии выращивали при 28°C в полноценной среде Luria-Bertani или минеральной среде Эванса (Evans et al., 1965), в которую в качестве единственных источников углерода добавляли КАП или АД в концентрации 0.1% (вес/объем). Выделение ДНК, клонирование фрагментов, ПЦР-анализ и секвениро-вание ДНК проводили стандартными методами (Sambrook et al., 1989).
Одним из подходов к изучению целевых генов в составе крупных плазмид является клонирование фрагментов плазмиды в подходящие векторы с последующим определением и анализом функциональных участков. Для клонирования фрагментов плазмиды pBS270 использовали вектор pFME5mini (2.6 т.п.н) — полученный нами ранее мини-репликон природной плазмиды pFME5, выделенной из штамма P. fluorescens FME5, который обеспечивал репликацию и поддержание генетических конструкций в клетках псевдомонад (Волкова, 2013). ДНК pBS270 и pFME5mini обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BamHI, смесь фрагментов плазмиды и вектора лигирова-ли Т4 ДНК-лигазой и трансформировали клетки штаммов P. putida КТ2442 и P. vignae 1025, которые не обладали способностью к росту на КАП и его интермедиатах. Селекцию трансформантов проводили на минеральной среде с КАП в качестве субстрата. В результате были получены колонии псевдомонад, содержащие pFME5mini со
КЛЮЧЕВАЯ РОЛЬ dca-ГЕНОВ В КАТАБОЛИЗМЕ epsilon-КАПРОЛАКТАМА araC dcaA ^_ _dcaH caiB/baiF etfa pntAA
dcaK
dcaR
dcaE
dcaF
etfß
fixC/etf-QO
ligB
Рис. 1. Схема генетической организации BamHI-фрагмента плазмиды pBS270 (15111 п.н.), содержащего кластер dca-генов.
"вставкой" размером около 15 т.п.н. Далее BamHI-фрагмент pBS270 был реклонирован в Escherichia-Pseudomonas шаттл-вектор pUCP22, что позволило манипулировать с плазмидной ДНК в клетках E. coli, а функциональный анализ полученной конструкции, обозначенной pTE270-15, проводить в бактериях Pseudomonas. Для определения нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента использовали стратегию "прай-мер-опосредованной прогулки".
В составе фрагмента размером 15111 п.н. были обнаружены 13 открытых рамок считывания (ОРС), 2 из которых оказались неполными (рис. 1). Предполагаемые функции белковых продуктов каждой ОРС выявляли c использованием сервиса BLAST [http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi] на основе гомологии с известными нуклеотидными и аминокислотными последовательностями. Проведенный анализ позволил идентифицировать в составе pTE270-15 кластер из 6 генов, порядок расположения которых оказался аналогичен структуре ранее охарактеризованного dca-оперо-на (от dicarboxylic acid) в геноме штамма Acineto-bacter sp. ADP1 (Parke et al. 2001). Таким образом, в составе САР-плазмиды pBS270 обнаружены гены dcaKAREHF, белковые продукты которых участвуют в окислении и транспорте высших дикарбоно-вых кислот, представителем которых является адипиновая кислота (см. схему катаболизма КАП). Ниже dcaEHF по ходу цепи ДНК расположены гены, продукты которых проявляли высокий уровень сходства с белками CaiB/ВaiF, Etfa и Etfß Pseudomonasputida SJ3 (94, 87 и 91% идентичных аминокислот соответственно) и белком FixC Pseudomonas taiwanensis SJ9 (94% идентичности). По имеющимся данным, эти ферменты и белковые продукты-акцепторы могут участвовать в переносе электронов в окислительно-восстановительных реакциях, сопряженных с метаболизмом дикарбоновых кислот или специфических субстратов (Watmough et al., 2010). Продукт ОРС, обнаруженной ниже dcaK, имел наибольшее сходство с транскрипционным регулятором AraC штамма Ralstonia sp. 5747 (53% идентичности).
Изучение динамики роста штаммов P. putida KT2442(pBS270) и P. putida KT2442(pTE270-15), показало, что обе плазмиды обеспечивали сходный рост клеток на минеральной среде с АД в качестве единственного источника углерода. Однако рост
штамма P. putida KT2442(pTE270-15) на среде с КАП характеризовался более длительным лаг-периодом по сравнению с P. putida KT2442(pBS270) (рис. 2а). Аналогичные результаты были получены и для соответствующих производных штамма P. vignae 1025 (данные не приводятся). Такое различие в динамике роста связано с тем, что природная плазмида pBS270, как было показано ранее, содержит всю генетическую информацию, необходимую для полной утилизации ксенобиотика (Еси-кова и соавт., 1990). Поскольку рТЕ270-15 содержит только dca-оперон, то для биодеградации КАП в данном случае требуется совместное участие двух генетических систем, находящихся в транс-положении (dca-гены — на плазмиде, а гены, кодирующие синтез ферментов, осуществляющих первичные этапы катаболизма ксенобиотика — на хромосоме).
Известно, что способность окислять высшие дикарбоновые кислоты, в том числе и АД, не характерна для бактерий рода Pseudomonas. Описаны лишь единичные штаммы псевдомонад, в частности, P. aeruginosa РАО1, обладающие таким свойством (Parke et al., 2001; Stanier et al., 1966). Следует отметить, что в геноме штамма P. aeruginosa РАО1 аннотированы гены, гомологичные dca-генам Acinetobacter sp. ADP1 (Stover et al., 2000). Исходя из полученных результатов, мы предположили, что наличие в штаммах псевдомонад dca-генов, локализованных на плазмидах или хромосоме, играет ключевую роль в появлении у них способности к катаболизму КАП. Изучение роста штамма P. aeruginosa РАО1 на минеральной среде с КАП подтвердило это предположение. Из данных, представленных на рис. 2б видно, что штамм P. aeruginosa РАО1, обладающий способностью утилизировать АД, после длительного культивирования демонстрировал рост на минеральной среде с КАП в качестве единственного источника углерода. Штаммы P. putida КТ2442 и P. vignae 1025, изначально не утилизирующие АД, так и не приобрели способность к деградации капролактама.
Таким образом, в составе плазмиды биодеградации капролактама обнаружен кластер dca-ге-нов, кодирующих ферменты окисления высших дикарбоновых кислот. Полученные результаты являются первыми сведениями об организации генов, вовлеченных в катаболизм КАП и локали-
АД
KOE/мл 1.00E+10
1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
KOE/мл 1.00E+10
1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
ЕСИКОВА и др. (а)
KOE/мл 1.00E+10
2 1.00E+09 -
КАП
1.00E+08 -
1.00E+07
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Время, ч
1.00E+06
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Время, ч
(б)
АД
КАП
j_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_L_
KOE/мл 1.00E+10 -
1 1.00E+09 -
1.00E+08 1.00E+07 1.00E+06 1.00E+05
0 4 8 12162024283236404448525660
Время, ч
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Сутки
1
Рис. 2. Динамика роста штаммов рода Pseudomonas в минеральной среде, содержащей адипиновую кислоту (АД) и ep-silon-капролактам (КАП) в качестве единственных источников углерода и энергии: (а) плазмидосодержащих производных P. putida KT2442: 1 — P.putida KT2442(pTE270-15), 2 — P. putida KT2442(pBS270); (б) бесплазмидных штаммов: 1 — P. aeruginosa PAO1, 2 — P. putida KT2442, 3 — P. vignae 1025.
зованных на САР-плазмиде. Показано, что наличие dca-генов, локализованных на плазмидах или хромосоме, необходимо для осуществления бактериями рода Pseudomonas катаболизма неприродного соединения капролактам. Примечательно, что dca-оперон у штамма Acinetobacter sp. ADP1 входит в состав хромосомного геномного острова "island of catabolic diversity", кодирующего деградацию различных ароматических с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.