ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2014, том 64, № 1, с. 54-63
ФИЗИОЛОГИЯ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ (ПСИХИЧЕСКОЙ) ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА
УДК 612.822.3
КЛЮЧЕВАЯ РОЛЬ КАЛЬЦИЯ В МЕХАНИЗМЕ ДЕПРИВАЦИОННОЙ ПОТЕНЦИАЦИИ ПОПУЛЯЦИОННЫХ ОТВЕТОВ НЕЙРОНОВ ПОЛЯ СА1 ГИППОКАМПА
© 2014 г. В. А. Попов, В. А. Маркевич
Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, e-mail: v-lad-i-mir@yandex.ru Поступила в редакцию 01.08.2013 г. Принята в печать 26.09.2013 г.
В работе на переживающих срезах гиппокампа крыс in vitro исследовали роль Са2+ в механизме депривационной потенциации популяционных ответов (поп-спайков) нейронов поля СА1, которая индуцировалась вследствие длительного (60 мин) прерывания редкой тестовой стимуляции коллатералей Шаффера. Выделены две фазы депривационной потенциации предположительно разного генеза: начальный кратковременный "пик" (около 12 мин) и длительная фаза "плато" (более 1 ч). В работе показано, что присутствие в растворе проникающего хелатора Са2+ (BAPTA-AM), понижение концентрации Са2+ в растворе, а также истощение внутриклеточного кальциевого депо (в присутствии в растворе тапсигаргина/циклопиазоновой кислоты) приводили к редукции кратковременной и блокированию длительной фаз депривационной потенциации. Таким образом, показана ключевая роль как внеклеточного, так и депонированного внутриклеточного Са2+ в механизме развития депривационной потенциации.
Ключевые слова: депривационная потенциация, кальций, срезы гиппокампа, поп-спайк, BAPTA-AM, тапсигаргин, циклопиазоновая кислота.
The Key Role of Calcium in the Mechanism of Deprivational Potentiation of Population Responses in Hippocampal CA1 Neurons
V. A. Popov, V. A. Markevich
Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, Moscow,
e-mail: v-lad-i-mir@yandex.ru
We investigated a role of calcium in the mechanisms of deprivational potentiation (DeP) of the popspikes amplitude of CA1 neurons that was induced in consequence of long (60 min) interruption of rare test stimulation (0.05 Hz) of Schaffer collaterals in rat hippocampal slices. There are two phases of deprivational potentiation that have presumably different genesis: short-term initial "peak" (about 12 min) and long-term "plateau" (more than 1 h). The presence of the membrane permeable Са2+ chelator (BAPTA-AM) in the solution, or decrease of [Са^]^, or depletion of intracellular Са2+ stores (in the presence of thapsigargin/cyclopiazonic acid) led to reduction of the short-term and to suppression of the long-term phases of DeP. Thus the key role of calcium in the DeP induction mechanisms and participation of two main sources (the extracellular environment and the intracellular Са2+ stores) was demonstrated.
Keywords: deprivational potentiation, calcium, hippocampal slices in vitro, pop-spike, BAPTA-AM, thapsi-gargin, cyclopiazonic acid.
DOI: 10.7868/S0044467714010092
В основе современных представлений о механизме обучения и памяти лежит концепция синаптической пластичности — зависимых от афферентной активности изменений
эффективности синаптической передачи [Bliss, Collingridge, 1993; Collingridge et al., 2010; Lynch, 2003]. Ранее в экспериментах на переживающих срезах гиппокампа in vitro на-
ми было показано, что прерывание стимуляции коллатералей Шаффера (от 10 мин до 4 ч) приводит к значительной (до 100% от базового уровня ответов) длительной (сохраняемой более 1 ч) входоспецифичной потенциации популяционных ответов нейронов поля СА1, тогда как в контрольных экспериментах при постоянной тестовой стимуляции достоверных изменений ответов не наблюдалось [Попов, 1994; Попов, Маркевич, 2001]. Этот вид потенциации мы назвали депривационной (ДеП) (лат. deprivatio — потеря, лишение). Аналогичные результаты были получены нами в хронических экспериментах in vivo на крысах в условиях наркотического сна при регистрации популяционных спайков нейронов зубчатой фасции на стимуляцию волокон медиального перфорантного пути [Попов, Маркевич, 1999]. Известно, что ион кальция (Са2+), являясь ключевым вторичным посредником в различных путях сигнализации, участвует почти во всех клеточных физиологических функциях, и даже небольшие изменения его гомеостаза приводят к глубоким функциональным изменениям, включая си-наптическую пластичность [Gleichmann, Mattson, 2011; Kawamoto, Camandola, 2012; Malenka et al., 1989; Nikoletopoulou, Tavernar-akis, 2012]. Ранее нами было показано, что динамика развития ДеП, а также нарушение ДеП как в присутствии блокатора протеин-киназы С (ПКС), так и после предварительной индукции LTP (оба условия для блокады ПКС-зависимой фазы LTP [Frey et al., 1995; Reymann et al., 1988; Reymann, 1993]) свидетельствуют о сходстве механизмов, ответственных за развитие ДеП и фазы LTP, связанной с фосфорилированием белка [Попов, Маркевич, 2001]. В свою очередь это дало нам основание для предположения об участии Са2+ в механизме развития ДеП.
Целью настоящей работы была проверка роли Са2+ в механизме развития ДеП, а также поиск его вероятных источников.
МЕТОДИКА
Эксперименты проводили на переживающих срезах гиппокампа самцов крыс линии Вистар массой 150—200 г, перед декапитацией использовали эфирный наркоз. Три среза толщиной 400 мкм помещали в инкубацион-но-регистрационную камеру с неглубоким погружением в раствор — искусственную цереброспинальную жидкость (ИЦСЖ). Состав
раствора (мМ): NaCl - 124, KCl - 3, NaHCO3 -26, ^2P04 - 1.25, CaCl2 - 2.2, MgCl2 - 1.8 (в растворе с пониженным содержанием кальция концентрации CaCl2 и MgCl2 были соответственно 1.0 и 3.0), D-глюкоза-Ю; газовая смесь: 95% 02 - 5% C02; pH 7.4; температура раствора в камере 32°C. Насыщение ИЦСЖ газовой смесью осуществлялось методом противотока в начальном термостати-руемом отсеке проточной системы (25 мл). Рабочий объем регистрационной камеры 0.9 мл, скорость протока 0.9 мл/мин. Оригинальное устройство камеры с равномерным двусторонним протоком раствора над и под срезом позволяет осуществлять длительную регистрацию ответов без фиксации срезов. Время инкубации срезов до вживления электродов и начала стимуляции составляло 2 ч.
Регистрацию суммарных ответов, популя-ционных спайков (пС) осуществляли в пирамидном слое поля СЛ1 гиппокампа стеклянными микроэлектродами, заполненными 2 M раствором NaCl (сопротивление электродов 3-5 MOм). Амплитуда пС измерялась от первого положительного до отрицательного пиков ответа.
Монополярные стимулирующие электроды (электролитически заточенная и покрытая винифлексовым лаком вольфрамовая проволока толщиной 100 мкм) устанавливали в область коллатералей Шаффера в средней части радиального слоя поля СЛ1 гиппокампа.
Регистрацию ответов на тестовую стимуляцию начинали после 30-60 мин предварительной стимуляции (период стабилизации ответов). Параметры тестовой стимуляции: частота 0.05 Гц, длительность стимула 100 мкс, амплитуду подбирали таким образом, чтобы амплитуда ответа составляла примерно 30% от его максимального значения (обычно около 40-50 мкА).
Для индукции ДеП после тестирования базового уровня ответов стимуляцию прерывали на 60 мин, затем возобновляли раздражение исходными параметрами тестовой стимуляции; в контрольных опытах тестовую стимуляцию с частотой 0.05 Гц проводили в течение всего эксперимента.
В работе использовали следующие препараты: селективный хелатор кальция (мембра-но-проникающая форма), 1,2-Bis(2-amino-5-fluorophenoxy)ethane-N,N,N' ,N'-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl) ester (BAPTA-AM, "Sigma", США), 30 мкМ; ингибиторы Са2 +-
АТФазы в саркоплазматическом и эндоплаз-матическом ретикулуме, тапсигаргин (thapsi-gargin, "ICN", США), 1 мкМ и циклопиазо-новая кислота (cyclopiazonic acid, "Sigma"), 1мкМ. Предварительно каждый из препаратов растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (dimethyl sulfoxide, "Sigma"), концентрация которого в ИЦСЖ составляла 0.05% для тапсигаргина и циклопиазоновой кислоты и 0.2% для BAPTA-AM. Отдельные контрольные пробы на влияние растворителя были проведены с концентрацией ДМСО 0.2%.
Базовые растворы разводили до конечных концентраций в ИЦСЖ примерно за 10 мин до переключения проточной системы.
Регистрируемые ответы усредняли по 10 предъявлениям стимулов (соответствует одной точке графика). За 100% (базовый уровень ответов) принимали усредненные ответы на последние перед паузой 10 стимулов (в контрольных экспериментах — усредненные 10 ответов соответствующего временного интервала). Достоверность различий полученных результатов оценивали по t-критерию Стьюдента (использован пакет программ Sig-maStat 3.1).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В экспериментах (n = 14) 60-минутное прерывание редкой (0.05 Гц) тестовой стиму-
ляции коллатералей Шаффера приводило к развитию ДеП — увеличению амплитуды по-пуляционных спайков (пС), регистрируемых в пирамидном слое поля СА1 (рис. 1, А). Сразу после возобновления тестовой стимуляции амплитуда ответов была максимальной и составляла 173.1 ± 7.0% относительно базового уровня ответов, затем в течение примерно 10—12 мин падала, после чего стабилизировалась на уровне около 150% (значения усредненных 12 ответов в интервале 72—120 мин колебались в диапазоне от 145.6 ± 6.5 до 151.2 ± ± 7.2%, в среднем составляя 148.9%). Таким образом, в картине ДеП можно различить две составляющие: начальный кратковременный "пик" и последующую фазу "плато". Ранее подобный начальный "пик" в большей или меньшей мере наблюдался при подавлении ДеП в среде с полимиксином B (блокатором ПКС) и после предварительной индукции LTP [Попов, Маркевич, 2001], что может свидетельствовать о различной природе ранней и поздней фаз ДеП.
Наличие общих черт у механизмов ДеП и ПКС-зависимой фазы LTP, связанной с фос-форилированием белка, дало основание для предположения об участии Са2+ в механизме развития ДеП. Для проверки этой гипотезы процедуру индукции и тестирования ДеП при 60-минутной депривации (прерывание стимуляции) мы проводили на фоне хелатора
Рис. 1. Роль Са2+ в развитии депривационной потенциации (ДеП). А — "нормальное" развитие ДеП: 60-минутное прерывание тестовой стимуляции (депривация) пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.