МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 199-203
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.8.013 : 546.[73+ 76]
КОБАЛЬТ- И ХРОМСОДЕРЖАЩИЕ ВКЛЮЧЕНИЯ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ
© 2004 г. Е. В. Арискина, А. В. Вацурина, Н. Е. Сузина, Е. Ю. Гавриш
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино Поступила в редакцию 21.07.2003 г.
Бактерии, принадлежащие к различным таксономическим и физиологическим группам (представители родов Pseudomonas, Brevibacterium, Rhodopseudomonas и Lactococcus), способны формировать Co- или Cr-содержащие магнитные включения. В статье рассматривается структура и внутриклеточная локализация Co- или Cr-содержащих образований, а также их сходство с известными некристаллическими магнитными железосодержащими включениями. Обсуждается возможная биологическая роль магнитных включений.
Ключевые слова: бактерии, магнитные включения, кобальт, хром.
Известна способность бактерий сорбировать катионы металлов из окружающей среды на клеточной стенке, белковых Б-слоях и капсулах, а также во внутриклеточных гранулах полифосфатов. Эти процессы являются широко распространенными и низкоспецифичными [1-3]. Значительно более редкое явление представляют собой внутриклеточные структурированные отложения металлов. У прокариот описано три типа подобных структур (все на основе железа): магнитосомы в клетках магнитотактных бактерий [4], некристаллические реагирующие на магнит структуры [5] и гранулы оксида железа в клетках диссимилятор-ного железоредуктора Shewanella putrefaciens [6]. Первые два типа включений делают возможным перемещение клеток под влиянием магнитного поля (магнитотаксис и пассивное притяжение к магниту соответственно) [7]. Нами были представлены предварительные данные о возможности аккумуляции в клетках бактерий ферромагнитных металлов, отличных от железа [8]. Данная работа посвящена описанию структуры и локализации кобальт- и хромсодержащих магнитных включений в клетках бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы. В работе были использованы культуры из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ): Pseudomonas fluorescens ВКМ В-2170; Lactococcus lactis subsp. lactis ВКМ В-978; Rhodopseudomonas palustris ВКМ В-1620, Rhodospirillum rubrum ВКМ В-1621, Brevibacterium linens ВКМ Ас-2112, ВКМ Ас-2119 Brevibacterium sp. ВКМ Ас-2118.
Среды и культивирование. P. fluorescens ВКМ В-2170 выращивали на мясопептонном агаре (среда ВКМ № 5 [9]) с дополнительным внесением NaNO3 (1 г/л); L. lactis ВКМ В-978 - на готовой среде "Триптозо-соевый бульон" ("Difco", 0370-01-1); штаммы Brevibacterium - на пептонно-дрожжевой среде с глюкозой; фототрофные бактерии - на среде следующего состава (г/л дистиллированой воды): дрожжевой экстракт - 0.5, сукцинат Na -1.0, ацетат Na - 2.0, NH4Cl - 0.5, KH2PO4 - 0.5, MgSO4 ■ 7H2O - 0.4, морская соль - 0.5. Конечная величина pH всех сред составляла 6.5-7.2. Выращивание проводили в пробирках Хангейта в микроаэробных условиях при оптимальных для каждого конкретного штамма температурах в течение 7-14 сут.
Условия образования Co- и Cr-включений.
Для изучения способности бактерий образовывать кобальт- и хромсодержащие магнитные включения в соответствующую среду вносили следующие растворы солей: 1) K2Cr2O7 - 40 мг; ЭДТА - 50 мг; вода дистиллированная - 10 мл; 2) K2Cr2O7 - 40 мг; вода дистиллированная - 10 мл; 3) CoCl2 ■ 6H2O -60 мг; ЭДТА - 50 мг; вода дистиллированная -10 мл; 4) CoCl2 ■ 6H2O - 60 мг; вода дистиллированная - 10 мл (до конечной концентрации ионов металлов в среде (мМ) 0.25, 0.5, 0.7, 1, 2, 4 и 9). В качестве контрольных вариантов использовали те же бактериальные культуры, выращенные без внесения металлов. В сравнительных опытах с образованием описанных ранее [5, 10] железосодержащих магнитных включений использовали Na-Fe(III) хелат ЭДТА. Все среды и добавки стерилизовали в течение 30 мин при 110°С.
Обнаружение движения к магниту. Клетки осаждали центрифугированием, осадок дважды промывали физиологическим раствором (0.8% NaCl),
подкисленным HCl (конечная величина рН 5.0) для удаления оседающих на поверхности клеток соединений металлов. Затем осадок ресуспенди-ровали в физиологическом растворе (рН 6.5-7.0). После отстаивания суспензии вплотную к стенке пробирки прикладывали магнит (2 Т). В случае положительной реакции на магнит наблюдали движение массы клеток в виде плотного сгустка биомассы, перемещающегося в сторону магнита. Перенос магнита к противоположной стороне пробирки вызывал перемещение клеток в сторону нового расположения магнита.
Электронная микроскопия. Для приготовления тотальных препаратов каплю суспензии клеток (отмытых или не отмытых от питательной среды) помещали на 30-40 с на медную сеточку (300 меш). Поддерживающей основой служила формваровая пленка. Контрастирование не использовали. Ультратонкие срезы получали по методу, описанному в работе [10]. Препараты исследовали в электронном микроскопе JEM-100B (Япония) при напряжении 80 кВ.
Рентгеновский микроанализ. Рентгеновский микроанализ элементного состава магнитных включений, а также изолированной фракции магнитных частиц проводили с помощью электронного микроскопа JEM-100CXII (JEOL, Япония), снабженного сканирующей приставкой EM-ASID4D и рентгеновским микроанализатором LINK-860 с детектором E5423 ("Link-System", Англия), при увеличении Х20000 и напряжении 60 кэВ. Препараты для просмотра представляли собой ультратонкие срезы клеток, содержащих магнитные включения, а также изолированные магнитные частицы. Суспензию магнитных частиц наносили на медные сетки с карбонизированной формваро-вой пленкой и напыляли углеродом под углом 90°. Спектры обрабатывали с помощью компьютерной программы LAF/PB.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Бактерии, выросшие на средах, содержащих хе-латы или нехелатированые соединения хрома(У!) либо кобальта(П), образовывали в цитоплазме специфические включения, придающие клеткам способность к пассивному перемещению в магнитном поле. Эти внутриклеточные образования были представлены сферами или глобулами диаметром от 20 до 250 нм. Анализ ультратонких срезов показал, что у всех бактерий внутреннее строение включений одинаково и сходно с описанными ранее железосодержащими включениями в клетках пурпурных фототрофных бактерий [10, 11]. Все они имели обогащенный соответствующим металлом матрикс гомогенной структуры, который обладал плотностью по отношению к электронам, достаточной для идентификации описанных вклю-
чений без дополнительных контролей, и центральную часть, прозрачную для электронов.
Провести статистически достоверный подсчет накопления включений в бактериях в зависимости от источника металла в среде и его концентрации не удалось, поскольку разные клетки содержали различное количество магнитных частиц, а некоторые были свободны от включений. В то же время прослеживалась тенденция к увеличению относительного количества включений в клетке при повышении концентрации металлов, которая, однако, не сказывалась на локализации и размере включений.
В отличие от железосодержащих включений, которые формировались лишь на основе хелати-рованных соединений железа(Ш), кобальт- и хромсодержащие включения образовывались как при добавлении ЭДТА, так и в присутствии нехе-латированных солей этих металлов. Рост бактерий и формирование включений наблюдались до следующих концентраций: Со - 2 мМ, Со-ЭДТА -9 мМ, Сг - 1 мМ и Сг-ЭДТА - 0.5 мМ. Как видно, токсическое воздействие хрома проявлялось в большей степени у хелатированной формы металла. Напротив, Со-ЭДТА комплекс был низко токсичен, возможно, вследствие его чрезвычайно высокой стабильности.
При изучении внутриклеточной локализации Со- и Сг-содержащих магнитных включений было обнаружено, что их расположение может отличаться от расположения Бе-содержащих включений в клетках того же штамма. Так, штамм Р. /¡иогв8сет ВКМ В-2170 в среде с хелатом железа образовывал мелкие (до 25 нм в диаметре) многочисленные включения в центральной части клетки (рис. 1), тогда как в средах с кобальтом и хромом эта культура формировала не более 10-15 относительно крупных (80-170 нм) магнитных включений, неравномерно распределенных по всей цитоплазме клетки [11]. У штаммов Бтеу1-ЪаМепиш и Ь. Iас№ ВКМ В-978 кобальт- и хромсодержащие включения не отличались по виду и расположению от железосодержащих: многочисленные структуры размером в 30-50 нм располагались под цитоплазматической мембраной и в цитоплазме клетки. У фототрофных бактерий основное количество кобальта и хрома было сосредоточено в крупных включениях у полюсов клетки (рис. 2).
Как и в случае с магнитными включениями, содержащими железо [5, 8, 10], описываемые структуры не содержали ни фосфора, ни серы, что было обнаружено при анализе тонких срезов клеток методом рентгеновского анализа (рис. 3а, 36). Исследования также показали, что клетки, выращенные на среде с кобальтом или хромом, накапливают указанные металлы лишь в электронно-плотной части включений. Ни в центральной части магнитных
(а) 1-1 (б) 1—1
т % (в) 1-1 (г) 1-1
Рис. 1. Клетки Р. fluorescens ВКМ В-2170 с магнитными включениями, содержащими: а - кобальт; б - хром, в - железо, г - контроль (среда без дополнительного внесения металлов). Электронная микроскопия; тотальный препарат клеток, взятых из зоны пробирки вблизи магнита. Стрелками указано расположение магнитных частиц. Размер масштабного отрезка соответствует 0.5 нм.
(а)
(б)
(в)
Рис. 2. Клетки R. palustris ВКМ В-1620 с магнитными включениями, содержащими: а - кобальт; б - хром, в - контроль (среда без дополнительного внесения металлов). Электронная микроскопия; тотальный препарат клеток, взятых из зоны пробирки вблизи магнита. Стрелками указано расположение магнитных частиц. Размер масштабного отрезка соответствует 0.5 нм.
Усл. ед. 600 г
400
200
0 600
400
200
Mg S
K
(а)
Co *
Mg S K
(б)
Cr
2
4
кеВ
Рис. 3. Рентгеновские спектры элементного состава магнитных частиц в интактных клетках R. palustris ВКМ В-1620, выращенных на средах с дополнительным внесением металлов: а - кобальта; б - хрома. Местоположение химических элементов обозначено на рисунке вертикальными лини
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.