ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 3, с. 356-363
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 578.287
КОДИРУЮЩИЕ НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ КРОВИ ЛЮДЕЙ БЕЗ КЛИНИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ ИНФЕКЦИИ
© 2010 г. С. И. Беликов1, Г. Н. Леонова2, И. Г. Кондратов1, Е. В. Романова1, Е. В. Павленко2
1Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск 664033;
e-mail: siberian47@mail.ru 2Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Владивосток 690087; e-mail: niiem@niiem-vl.ru Поступила в редакцию 28.04.2009 г.
Охарактеризованы геномы четырех штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных из крови людей после укуса клеща и не вызвавших клинических проявлений инфекции. При анализе транслированных полипротеинов выявлена 21 аминокислотная позиция, характерная для этой группы штаммов и отличающаяся от других ранее изученных штаммов вируса клещевого энцефалита дальневосточного субтипа. Только три мутации приводят к существенным изменениям аминокислот, которые, вероятно, могут влиять на тяжесть течения инфекционного процесса. Высказано предположение о том, что две сочетанные мутации, делеция 111-й аминокислоты в капсидном белке С и замена (Ser1534 —Phe) в белке NS3, оказывают влияние на строго согласованный ход про-цессинга полипротеина, нарушая правильное формирование вирусных частиц, что может приводить к образованию дефектных вирусных частиц, не содержащих РНК. Мутация в неструктурном белке NS1 (Ser917 —- Gly) приводит к замене гидрофильной аминокислоты, характерной для высоковирулентных штаммов, на гидрофобную, что может оказывать влияние на эффективность работы репликативного комплекса вируса и отражаться на инфекционности штаммов вируса клещевого энцефалита.
Клещевой энцефалит (КЭ) является наиболее значимой трансмиссивной природно-очаговой вирусной инфекцией лесной зоны Евразийского континента. Заболеваемость КЭ регистрируют более чем в 25 странах Европы и 7 странах Азии, в Российской Федерации (РФ) — на 46 административных территориях, в том числе на 18 территориях Сибири и Дальнего Востока. В Российской Федерации в 1990-х гг. ежегодно регистрировали более 10 тысяч случаев КЭ. В 2000-х гг. интенсивный показатель заболеваемости КЭ по РФ стал заметно снижаться [1]. Несмотря на его снижение в 2006 г. до 2.44 на 100 тыс. населения, по мнению Г. Г. Онищенко [2], эпидемическая ситуация по КЭ в РФ остается напряженной.
Известно, что клиническое течение заболевания в регионах существенно различается. В европейской части континента заболевание зачастую протекает в виде двухволновой лихорадки, в Сибири превалируют лихорадочные и менингеаль-ные формы, а на Дальнем Востоке чаще, чем в других регионах, регистрируют очаговые формы заболевания. Летальность в разных регионах также варьирует в очень широком диапазоне — от 0.03% до 20—35% с максимальными показателями на территории Дальнего Востока. Причина вариабельности основного эпидемиологического по-
казателя летальности, вероятнее всего, может быть обусловлена циркуляцией различающихся по вирулентности штаммов вируса КЭ на этих территориях. Действительно, вирус КЭ подразделяют на три основных субтипа, название которых связано с основным ареалом их распространения, — западный (европейский), дальневосточный и сибирский [3—5]. В то же время однозначной зависимости между субтипом вируса и тяжестью заболевания не существует, о чем свидетельствует тот факт, что от умерших больных клещевым энцефалитом людей выделены штаммы всех трех субтипов вируса КЭ. Особенно хорошо заметно несоответствие между субтипом вируса и тяжестью клинического течения заболевания на Дальнем Востоке, где преимущественно циркулируют штаммы дальневосточного субтипа вируса КЭ. В последние годы нам удалось установить неоднородность дальневосточной вирусной популяции, штаммы которой способны вызывать у больных различную тяжесть заболевания с различными формами, от очаговой до инаппарантной инфекции [6]. При анализе фрагмента генома длиной 160 нуклеотидов эти штаммы вируса КЭ имели отличия [7, 8]. Короткая длина проанализированного фрагмента не позволила сделать окончательные выводы, но для нас стало очевидно, что суще-
ствуют штаммы вируса КЭ дальневосточного субтипа с различной степенью вирулентности, у которых в геноме могут быть мутации, оказывающие влияние на тяжесть течения инфекционного процесса. Конечно, тяжесть течения заболевания зависит не только от генетических особенностей штамма вируса, но и от состояния макроорганизма (наследственный фактор, пол, возраст, наличие сопутствующих заболеваний и т.д.), которое пока не поддается анализу. В данной работе мы попытались вычленить непосредственное влияние особенностей генома вируса путем сравнительного полногеномного анализа нескольких штаммов вируса, отличающихся сниженной ней-ровирулентностью для человека. Мы считаем, что полногеномное секвенирование большого количества штаммов вируса КЭ, выделенных от больных с легким течением заболевания, и сравнение их с последовательностями штаммов, выделенных от умерших людей, поможет определить спектр мутаций, влияющий на изменение вирулентности штаммов вируса клещевого энцефалита.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы вируса КЭ. В настоящей работе нами изучено четыре штамма вируса КЭ: Рптогуе-212 (Р-212), Рптогуе-253 (Р-253), Рптогуе-270 (Р-270) и Рптогуе-332 (Р-332), которые были изолированы в 1991 г. из крови людей на 2-3-й день после "укуса" клеща в лесной зоне юга Дальнего Востока, в пригородной зоне Владивостока и Надеждин-ского района. У этих людей не зарегистрировано клинически выраженного заболевания КЭ.
В анализе нуклеотидных последовательностей кроме вышеуказанных штаммов использованы опубликованные в ОепВапк последовательности полипротеинов штаммов вируса КЭ, выделенных в Японии — штамма 08Ыта 5-10 (АВ062063), в Китае — 8еп2Ыап§ (АУ182009), в Приморском крае — 01иЫппое (DQ862460), в Хабаровском крае - 8о|]т-НО (АВ062064) и 205 ^989 336).
Культивирование штаммов вируса КЭ. Изоляцию вируса проводили на 2-суточных беспородных белых мышах, которых заражали кровью людей внутримозговым и подкожным способом. Инкубационный период при первичном заражении животных составлял от 6 до 10-12 сут, при пассажах он сократился до 4-5 сут. В работу были взяты штаммы 4-5-го пассажей.
Выделение РНК. Суммарную РНК из головного мозга больных мышей-сосунков выделяли с помощью набора Рибо-Золь-А ("АмплиСенс", Россия) согласно протоколу фирмы. Препараты суммарной РНК хранили после выделения в виде суспензии в 50%-ном изопропаноле при -20°С.
Получение кДНК и проведение ПЦР. Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью
набора Реверта-L-lOO ("АмплиСенс", Россия) согласно протоколу фирмы. Амплификацию перекрывающихся фрагментов вирусного генома длиной около 1 тн осуществляли в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 65 мМ трис-HCl (pH 8.8), 20 мМ (NH4)2SO4, 0.01% твин-20, 10 пмол каждого праймера, 0.5 ед. Taq-полимеразы, 0.2 мМ каждого dNTP и 0.1—2 мкл препарата кДНК. Амплификацию проводили на приборе DYAD DNA Engine ("MG Research") в следующем режиме: 96°С — 1 мин, затем 30 циклов 96°С - 5 с, 60°С - 5 с, 72°С -1 мин. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 0.8%-ном геле агарозы в трис-ацетатном буфере (20 мМ трис-ацетат, pH 8.5) с добавлением бромистого этидия. Ампликоны из геля выделяли методом замораживания с последующим центрифугированием через микроцентрифужный фильтр. ДНК осаждали добавлением к элюату равного объема изопропанола.
Определение нуклеотидной последовательности. Терминирующие реакции проводили с помощью набора Genome Lab DTCS-Quick Start Kit ("Beckman Coulter") согласно протоколу фирмы-производителя. Анализ продуктов терминирующих реакций осуществляли на секвенаторе CEQ-8800 ("Beckman Coulter").
Математический анализ. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью пакета программ BioEdit и ClustalW.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Штаммы (Р-212, Р-253, Р-270, Р-332) были изолированы из крови людей с жалобами на укус клеща, никаких клинических проявлений инфекции у них зарегистрировано не было. Эти штаммы репродуцировались в перевиваемой клеточной культуре СПЭВ, вызывая цитопатическое действие. Титры вируса КЭ для этих штаммов составили: Р-212 - 3.0, Р-253 - 7.0, Р-270 - 8.0 и Р-332 - 4.5 lg ТЦД50/мл. При изучении их вирулентности для белых мышей установлено, что все штаммы обладают выраженной нейровирулент-ностью при внутримозговом и подкожном способах заражения, индекс инвазивности их на уровне 4-5 пассажей составлял от 0.6 до 2.2, что указывало на высокую степень нейроинвазивности этих изолятов (табл. 1).
Амплификацию кДНК проводили с использованием двух наборов праймеров, позволяющих получить фрагменты длиной около 1100 нуклео-тидов (н) с перекрыванием около 100 н. Второй набор праймеров был сдвинут на 500 н относительно первого набора для однозначного чтения места стыковки перекрывающихся фрагментов [9]. Длины геномов проанализированных нами штаммов равны: Р-212 - 10882 н, Р-253 - 10816 н, Р-270 - 10878 н и Р-332 - 10878 н (часть 3'-конца не прочитана), что сравнимо с полноразмерными
Таблица 1. Интенсивность накопления штаммов вируса клещевого энцефалита на разных биологических моделях (культура клеток СПЭВ, беспородные белые мыши при заражении в мозг и подкожно)
№ п/п Регистраци- Место заражения (район), год изоляции Титр вируса Титр вируса на белых мышах (lg LD50) в 1 мл
Штамм онный номер GenBank на СПЭВ (lg ТЦД50) в/м (Icer) п/к (Scut) Индекс инва-зивности (I.I.)
1 Primorye-212 (P-212) EU816450 Зеленый массив г. Владивостока, 1991 3.0 10.0 7.8 2.2
2 Primorye-253 (P-253) EU816451 Надеждинский (Соловей ключ), 1991 7.0 7.1 6.5 0.6
3 Primorye-270 (P-270) EU816452 Надеждинский (п. Мирный), 1991 8.0 7.1 5.6 1.5
4 Primorye-332 (P-332) AY169390 Надеждинский (п. Мирный), 1991 4.5 9.7 8.9 0.8
Примечание. в/м (Icer) — внутримозговое заражение, п/к (Scut) — подкожное заражение, (I.I.) — индекс инвазивности (разница титров при в/м и п/к способах за
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.