БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 2, с. 169-174
УДК 577.3
КОЭФФИЦИЕНТ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РИФАБУТИНА И ЕГО ИОНИЗИРОВАННЫХ ФОРМ В РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАХ
© 2007 г. В. В. Востриков, А. А. Селищева*, Г. М. Сорокоумова, В. И. Швец
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова,
119571, Москва, пр. Вернадского, 86; *Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119899 Москва, Воробьевы горы; электронная почта: selishcheva@inbox.ru
Поступила в редакцию 30.06.2006 г.
Исследованы зависимости от рН суммарного коэффициента распределения (К) противотуберкулезного препарата рифабутина в системе октанол/вода. Методом потенциометрического титрования в водном растворе и в системе липосомы/вода определены константы ионизации рифабутина. С их помощью рассчитаны коэффициенты распределения Кр ионизированных форм рифабутина в системе липосомы/вода. Для обеих систем показано, что наиболее гидрофобной является цвиттер-ионная форма рифабутина, а наименее гидрофобны заряженные формы. Дальнейшее увеличение заряда на молекуле рифабутина (дикатионная форма) делает ее менее гидрофобной. Величины Кр катионной формы рифабутина близки в обеих системах, Кр цвиттер-ионной формы в системе октанол/вода больше, чем в системе липосомы/вода. Полученные результаты указывают на более слабое проникновение рифабутина в виде цвиттер-иона в модельную мембрану по сравнению с октанолом.
Рифабутин (РБ) - полусинтетический антибиотик рифамицинового ряда, который способен подавлять размножение Mycobacterium tuberculosis как в среде инкубации, так и в инфицированных макрофагах [1]. Доступ антибиотика к внутриклеточному паразиту затруднен, так как препарат должен проникнуть через ряд мембранных структур (мембрана макрофага, мембрана фагосомы, клеточная стенка и мембрана самой микобакте-рии). В инфицированных макрофагах микобакте-рии находятся в фагосомах, где pH среды понижен до 6.4 по сравнению с нормой (рН 7.4) [2]. Принято считать, что содержание лекарственного препарата в клетке-мишени определяется в основном двумя его параметрами - растворимостью и коэффициентом распределения вещества между аполяр-ной и водной фазами (Kp) [3]. Kp рассчитывается по формуле (1) как отношение концентрации распределившегося вещества в неполярной фазе к его концентрации в водной фазе:
K _ C Apolar _ nApolarV Water
CWater nWaterVApolar
(1)
(К). Связь Кр и К для п форм описывается следующим выражением:
Kd _
(2)
где ф7 - доля 7-й формы вещества. Если же искомое вещество находится только в одной форме, то К равно Кр.
Ранее нами потенциометрическим, спектрофо-тометрическим и расчетным методами установлено, что в молекуле РБ ионизируются три группы с рКа 3.5, 6.5 и 9.5 [5]. Содержание разных форм РБ должно меняться при изменении рН среды, а значит, может изменяться и величина суммарного, эффективного значения Кс1. В литературе приведены данные о величине Ка для РБ в системе липосомы/вода и октанол/вода только при одном значении рН, равном 6.8 [6]. Целью настоящей работы было определение коэффициента распределения Кр ионизированных форм РБ в различных системах (липосомы/вода и октанол/вода) в зависимости от рН среды.
Параметр Кр используют в случае нейтральных соединений, которые не имеют в своем составе групп, способных к диссоциации в широком интервале рН [4]. В случае соединений, которые могут находиться в нескольких ионизированных формах (например, катион и цвиттер-ион), определяют параметр "суммарный коэффициент распределения"
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали РБ ("Upjohn", США); фосфатидилхолин сои (ФХ) - препарат Lipoid S-100 ("Lipoid", Германия) 94% чистоты. Доля отрицательно заряженных липидов не превышала 0.2%. Препарат был хроматографически чистым
n
Возможные ионизированные формы РБ и коэффициенты распределения этих форм в различных системах
Ионизированная форма* lg(^)** липид/вода lg(Kp)*** октанол/вода
A (дикатион) OH, N1H+, N2H+ - 0.64 ± 0.19
B (катион) OH, N1, N2H+ 2.15 2.01 ± 0.04
C (цвиттер-ион) O-, N1, N2H+ 3.28 3.92 ± 0.18
D (анион) O-, N1, N2 - 1.80 ± 0.03
E (нейтральная форма) OH, N1, N2 - -
F (катион) O-, N1H+, N2H+ - -
* Символы N1 и N2 соответствуют атомам азота имидазольной и пиперидиновой групп. ** Определено методом потенциометрического титрования. *** Определено методом разделения фаз.
(ТСХ в системе хлороформ : метанол : вода = 65 : : 25 : 4, проявление молибденовым синим). Все используемые растворители - х.ч. ("Химмед", Россия).
Спектры поглощения получали на спектрофотометре Beckman DU-7 HS ("Beckman Instruments Inc.", США). Потенциометрическое титрование проводили на рН-метре рН-410 ("Аквилон", Россия). Мультиламеллярные везикулы получали на гомогенизаторе EmulsiFlex C-5 ("Avestin Inc.", США).
Эксперименты по определению коэффициентов распределения РБ проводили в присутствии 0.15 М NaCl (физиологический раствор).
ОпределениеKd в системе октанол/вода. Навеску препарата РБ массой 20 мг растворяли в 1000 мл физиологического раствора. Из полученного раствора отбирали аликвоту и определяли величину оптической плотности при длине волны 279-284 и 317-320 нм, что соответствует максимумам поглощения РБ. рН раствора доводили до зна-
ф,- Заряд
Рис. 1. Содержание различных форм РБ в зависимости от рН, рассчитанное по уравнению (3) - левая шкала. А - дикатион; В - катион; С - цвиттер-ион; Б - анион. Зависимость от рН среды суммарного заряда в молекуле РБ - правая шкала.
чения 3, используя 1 М HCl. Вносили 4 мл октано-ла, после чего систему интенсивно перемешивали 2 ч. После отстаивания (не менее 20 ч) фазы разделяли, измеряли их объем и получали спектр поглощения водной фазы. Далее изменяли рН, добавляя 1 М раствор NaOH, и все операции повторяли в приведенной выше последовательности.
В дополнительных экспериментах методом ТСХ в системе хлороформ : метанол (9 : 1) показали, что при длительной инкубации РБ в водных растворах с рН в интервале 2.0-10.0 отсутствуют продукты его деструкции или окисления.
ОпределениеpKa РБ в водном растворе и в системе липосомы/вода методом потенциометрического титрования. Для получения мульти-ламеллярных везикул (далее - липосом) ФХ сои (62-1000 мг) диспергировали в 25 мл физиологического раствора, подвергали трем циклам замораживания-оттаивания и пропускали 4 раза через гомогенизатор. Размер полученных липосом, определенный методом турбидиметрии, составил 3.1 ± ± 0.1 мкм.
Для определения константы ионизации РБ в системе липосомы/вода (pK'a) предварительно определяли базовую линию, т.е. титровали стандартизованное основание (NaOH) сильной кислотой (HCl). Далее титровали липосомы из ФХ в соотношении липид/вода 1/100; 1/200 (концентрации ФХ 1.25 х 10-2 и 6.25 х 10-3 М). При этих же соотношениях проводили титрование РБ (4.7 х 10-4 М) в системе липосомы/вода в диапазоне рН 3.5-10.5 из щелочной области в кислую. Полученные кривые титрования преобразовывали в графики Бьеррума [3].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее несколькими методами было установлено, что РБ имеет три значения pKa: 3.5, 6.5, и 9.5, которые были соотнесены с ионизацией азота имидазольного цикла, ароматической гидрокси-группы в нафтольном цикле и азота пиперидино-
вой группы [5]. Из этих данных по уравнению Хен-дерсона-Хассельбаха (3) можно рассчитать содержание отдельных форм РБ в водном растворе в зависимости от рН среды [7].
рН = рКа + ^
[ X ] [ НХ ].
(3)
Возможные формы РБ перечислены в таблице. Следует отметить, что вклад форм Е и Г незначителен - их максимальная доля составляет < 0.1%, поэтому целесообразно рассматривать только формы А, В, С и Б (дикатионную, катионную, цвиттер-ионную, анионную). Распределение этих форм в зависимости от рН представлено на рис. 1, согласно которому РБ при физиологическом значении рН (7.4) существует преимущественно в виде цвиттер-иона (88%) с небольшой долей катиона (11%), а при понижении рН среды до 6.4 ситуация меняется: содержание обеих форм близко (соответственно 44 и 56%).
Величины Кр протонированных и депротониро-ванных форм можно рассчитать, используя метод потенциометрического титрования [4] или зная величины Кл при нескольких значениях рН.
Потенциометрическое титрование в водной среде позволяет определить константы ионизации вещества (рКа). Если в водный раствор исследуемого вещества внести органическую фазу, не смешивающуюся с водой, то вещество перераспределится между водной и органической фазами, и его концентрация в водной фазе уменьшится. При по-тенциометрическом титровании в двухфазной системе титруют вещество, находящееся в водной фазе. Если значение рКа, получаемое в этом случае, обозначить как рКа, то при рН = рКа будет наблюдаться равенство концентраций протониро-ванной [НХ] и депротонированной [X] форм в водной фазе, а значение рКа будет сдвинуто относительно рКа на величину 8 [4]:
8 = рК- рКа = ^
1 + г • К X
1 + г • К
НХ'
(4)
пНС1, моль
6.0 х 10-5 г
5.0 х 10-5
4.0 х 10-5 -
3.0 х 10-5
2.0 х 10-5 V.
1.0 х 10-5 -
Ч
ДпНС1, моль 3.5 х 10-5
3.0 х 10-5
2.5 х 10-5
2.0 х 10-5
1.5 х 10-5
1.0 х 10-5
5.0 х 10-6
0
10
рН
-
3
7
рН
10
Рис. 2. а - Кривые потенциометрического титрования липосом из ФХ с РБ (1) и липосом из ФХ (2). Концентрация ФХ - 6.25 х 10-3 М; РБ - 4.7 х 10-4 М. б - Разность количества титранта между образцами (1) и (2) -левая шкала; функция Бьеррума - правая шкала. Количество РБ - 1.19 х 10-5 моль.
Зная величину рКа и определив при двух значениях г величину рКа, можно определить Кр для протонированной и депротонированной форм, решив следующую систему уравнений [4]:
где рКа - значение рКа, измеренное в присутствии органической фазы (липиды), г - объемное соотношение органической и водной фаз (липид/вода),
КХ - коэффициент распределения депротонированной формы и К™ - коэффициент распределения протонированной формы [4]. Величина 8 может быть как положительной, так и отрицательной. В первом случае коэффициент распределения депротонированной формы должен быть выше, чем протонированной (что наблюдается для оснований), во втором - наоборот (что характерно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.