БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.5, с.836-841
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.579.57.05
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ KP ИТЕР ИИ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСПР ЕССИИ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ У ПР ИР ОДНЫХ И ТРАНСГЕННЫХ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕР ИЙ
© 2008 г. А.А. Гусев, Т.В. Каргатова*, С.Е. Медведева, Л.Ю. Попова*
Институт биофизики СО РАН, 660036, Академгородок 50/50, Красноярск;
*Красноярский Научный Центр СО РАН, 660036, А кадемгородок, Красноярск
E-mail: сс1Ъ80@1Ър.ти Поступила в p едакцию 10.07.07 г.
После доработки 28.02.08 г.
Предложен способ расчета для оценки эффективности экспрессии биолюминесценции у природных светящихся бактерий РНо1оЪас1вгшт leiognathi 54 и у трансгенных бактерий Es^eriMa соИ 2905/рРИЬ7 с клонир ованным в многокопийной плазмиде lux -опер оном, на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях. Показано, что на популяционном уровне пр еимущество имеют все варианты тр ансгенного штамма по сравнению с вар иантами прир одного штамма Р. leiognathi 54, независимо от типа регуляции lux -оперона. На клеточном ур овне у яр кого и тусклого вариантов трансгенного штамма наблюдается превышение эффективности экспрессии биолюминесценции на несколько порядков. На уровне одного lux -опер она эффективность экспрессии у яркого варианта трансгенного штамма значительно выше, чем у природного яр кого вар ианта, у тусклых вариантов они близки, а у темнового варианта E. соИ 2905-2/рРИЬ7 эффективность экспрессии биолюминесценции на два - тр и пор ядка меньше, чем у темнового варианта Р. leiognathi 54.
Ключевые слова: природные и трансгенные бактерии, эффективность экспрессии lux-оперона.
Считалось, что тр ансгенные микроорганизмы нестабильны генетически и при делении теряют плазмиды, а также нестабильны метаболически (имеют пониженную скорость роста и пониженный экономический коэффициент), что приводит к потере экспрессии клонированных генов и к их элиминации из аборигенного микробного сообщества. Однако имеющаяся фактическая информация о механизмах влияния генетических модификаций на популяционные и, тем более, экологические характеристики соответствующих штаммов свидетельствуют об обратном - плазмиды и другие генетические вставки не теряются; клетки с генетическими модификациями лучше адаптируются в меняющихся условиях окружающей ср еды, чем штаммы дикого типа, именно из-за пониженной активности метаболизма [1-5]. При этом в процессе практического использования трансгенных микроорганизмов эффективность экспрессии клонированных генов может значительно варьировать, что сопровождается высокой гетер огенностью популяций [6-7]. Одной из систем, позволяющей оценить эффективность и последствия шир окого использования клонированных фрагментов ДНК, является биолюминесцентная генетическая система в морских пр и-
родных и трансгенных светящихся бактериях, поскольку экспрессия биолюминесцентных опе-ронов зависит от структуры оперона и метаболической активности клетки-хозяина [8]. Данная генетическая система, с одной стороны, позволяет оценить эффективность экспрессии и измерить люминесценцию с помощью прибора (уровень трансляции). C другой стороны, по динамике люминесценции при периодическом культивировании можно оценить изменение в регуляции экспрессии lux -оперона (уровень тр анскрипции). Уровень р епликации может быть оценен количеством клонированных генов на клетку. Именно на клонированной биолюминесцентной системе предпринимались попытки количественной оценки стабильности экс-пр ессии гетерологичных вставок ДНК в новых клетках-хозяевах [9-11].
В данной работе рассматривается влияние метаболической активности клетки на эффективность экспрессии природного и клонированного в плазмиде lux -оперона из морских светящихся бактерий Photobacterium leiognathi.
Характеристики вариантов природных и трансгенных светящихся бактерий
Характеристики Виды светящихся бактер ий
Photobacterium leiognathi ЕБсИепсЫа соИ
54 54-1 54-2 Z905 Z905-1 Z905-2
Генотип lux+ lux+ lux+ lux+ lux+ lux+
Локализация lux -оперона 1 lux -опер он в хр омосоме 1 lux-оперон в плазмиде, 100-130 копий плазмид на клетку
Фенотип Aut++Ald+ Lum++ Aut+Ald+ Lum+ Aut+-Ald+- Lum+- Aut++Ald+ Lum++ Aut+Ald+ Lum+ Aut+-Ald+- Lum+-
Примечания. lux - Наличие биолюминесцентного оперона; Aut - фенотип по синтезу аутоиндуктора lux-оперона; Lum - фенотип проявления биолюминесценции в видимой области спектра; Ald - фенотип проявления зависимости биолюминесцентной реакции в экзогенном длинноцепочечном альдегиде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили морские светящиеся бактерии Photobacterium leiognathi, штамм 54 и трансгенный штамм Escherichia coli Z905/pPHL7 из коллекции культур Института биофизики СО РАН (CCIBSO 836) [12]. X ар актер истики вариантов исследуемых штаммов с разным уровнем экспрессии биолюминесценции представлены в таблице.
Полусинтетическая среда для культивирования светящихся бактерий содержала в 1 л дистиллир ованной воды 5 г пептона, 30 г хлорида натрия, 0,2 г MgSO4*7H2O, 1 г KH2PO4 6 г Na2HPO4, 0,5 г (NH4)2HPO4.
Периодическое культивирование штаммов пр оводили в колбах Эрленмейера на термостатированной качалке при 28°С. Оптическую плотность суспензии клеток измеряли с помощью фотоколор иметра КФК-2МП (Оптико-механический завод, Зеленоград) в 0,5-сантиметровой кварцевой кювете при длине волны 540 нм (зеленый фильтр). По результатам измерений оптической плотности с помощью калибровочных кривых определяли концентрацию клеток в суспензии. Ошибка измерения не превышала 17%. Интенсивность свечения измеряли на биолюминометре, сконструированном в СКТБ «Наука» (К расноярск). Сигнал регистр и-ровали на микроампер метре М -95. Данная установка позволяет измерять интенсивность свечения в диапазоне от 10-4 до 102 мкА (1 мкА = 4-109 квантов/с). Погрешность измерения люминесценции не превышала ±5%. Нулевая отметка времени культивир ования бактерий - время инокуляции. Первое измерение интенсивности свечения и концентр ации клеток производили через 1 ч после инокуляции, поскольку существует латентный период.
Количественными кр итериями эффективности экспрессии биолюминесценции служили: ко-пийность lux -оперона (уровень репликации) на клетку, длительность латентного периода в индукции биолюминесценции (уровень транскрипции), максимальная интенсивность свечения (уровень трансляции). И спользовали следующие обозначения количественных критериев и коэффициентов:
fi - число копий lux-оперонов на клетку (для пр ир одных морских бактерий один опер он в хромосоме, для трансгенных светящихся бак-тер ий показатель варьирует в зависимости от штамма). Число копий плазмид опр еделяли по электрофореграммам с помощью программы Stion Image;
/2 = 1/t - коэффициент (с-1), отражающий влияние латентного периода в динамике биолюминесценции на эффективность экспрессии lux -оперона. Латентный период - время от инокуляции до начала фазы линейного роста интенсивности свечения, если латентный период отсутствует, то /2 = 1 с-1;
/3 - максимальное значение биолюминесценции (квант/с);
эффективность экспрессии биолюминесценции на популяцию клеток:
^рор = Л х /з(квант/с2);
эффективность экспрессии биолюминесценции на одну клетку:
Foell = F^/N (квант/[с2хчисло клеток]);
эффективность экспрессии биолюминесценции на одну копию lux -опер она:
^0ру = Fexf1 (квант/[с2хчисло клеток хчисло копий lux -оперона]).
Рис. 1. Динамика биолюминесценции (а,б) и роста (в,г) вариантов природных светящихся бактерий P. leiognathi 54 и трансгенных светящихся бактерий E. coli 7905/рРИЬ7 с разным уровнем экспрессии lux -оперона. Варианты штаммов: P. leiognathi 54: 1 - 54; 2 - 54-1; 3 - 54-2 (а,в); E. coli 7905/рРИЬ7: 1 - Z905; 2 - Z905-1; 3 - Z905-2. I - биолюминесценция, кв/с; N - численность бактерий, кл/мл. Вертикальными линиями отмечены точки с максимальными значениями биолюминесценции для каждого варианта.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для поддержания в коллекции и для практического использования в популяции природного и трансгенного штаммов отбир аются клоны с наиболее ярким свечением (штаммы 54, Z905, рис. 1). Однако ввиду того, что скорость их роста несколько снижена, вскоре в популяции начинают доминировать клетки с более поздней индукцией биолюминесценции, но с близким к исходному уровню интенсивности свечения (варианты 54-1 и Z905-1, рис. 1). В стационар ной фазе р оста или при действии неблагоприятных факторов наблюдается тенденция к накоплению в популяции клеток, имеющих не только латентный период в экспрессии lux -оперона, но и проявляющих сни-
женный уровень интенсивности свечения. Это связано с перестройкой клеточного метаболизма, в частности приводящей к снижению концентрации альдегидного фактора - основного суб стр ата в люциферазной реакции (варианты 54-2 и Z905-2, рис. 1, таблица). По-видимому, для природных светящихся бактерий фактором, ограничивающим сверхэкспрессию lux -оперона, является уровень транскрипции, а для трансгенных светящихся бактерий - уровень трансляции, так как при индукции транскрипции экспрессия lux -оперона сразу с многих копий пр иводит к замедлению роста (р ис. 1б,г).
П р оведены расчеты изменения эффективности экспрессии биолюминесценции природными и трансгенными штаммами с разным типом
Рис. 2. Расчеты эффективности экспрессии биолюминесценции вариантами P. leiognathi 54 и E. coli 7905/рРБЬ7 на популяционном (а), клеточном (б) и молекулярном (в) уровнях. Варианты природного штамма P. leiognathi: 54 - яркий, 54-1 - тусклый, 54-2 - темный. Варианты трансгенного штамма E. coli 7905/рРБЬ7: Z905 - яркий, Z905-1 - тусклый, Z905-2 - темный.
пр оявления биолюминесценции пр и периодическом культивировании. На популяционном ур овне основным показателем является максимальный уровень интенсивности свечения, а дополнительным - время до начала индукции экспрессии lux -оперона (латентный пер иод в биолюминесценции), т.е. чем короче латентный пер иод, тем эффективнее работает светящийся
штамм. На р ис. 2а видно, что яркий вар иант тр ансгенного штамма и яркий вариант природного штамма имеют близкие значения эффективности экспрессии, несмотря на то, что пр и-родный вариант им
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.