— ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ —
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА CD4+CD25вright РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
© 2007 Д.С. Сибиряк1, С.В. Сибиряк1, Р.Ш. Юсупова2, Н.Н. Курчатова2, В.А. Черешнев1
1 Институт иммунологии и физиологии УрОРАН, Екатеринбург, Россия; 2 ГУЗ ВЦГПХ МЗ РФ, Уфа, Россия
Поступила: 17.01.07 г. Принята: 02.04.07 г.
Оценено содержание CD4+CD25Bгigth естественных регуляторных Т лимфоцитов (Трег) в периферической крови 46 условно-здоровых доноров — добровольцев (18 мужчин и 28 женщин) различных возрастных групп (20 — 40 лет, 41—60 лет и более 61 года). Содержание CD4+CD25Bгigth Трег среди всей популяции CD3 + T лимфоцитов составило (M±SD) 1,45±0,59%, среди популяции CD3 + CD4+ лимфоцитов 3,30±1,39% и 7,00±3,01% среди популяции CD4+CD25Total клеток. Процентное содержание Трег имеет тенденцию к снижению у женщин и пожилых лиц; доля CD4+CD25Bгight Трег лимфоцитов как среди всей популяции CD3 + CD4+ клеток, так и среди CD4+CD25+ лимфоцитов значимо ниже; абсолютное содержание CD4+CD25Bгight Трег клеток ниже у женщин.
Ключевые слова: регуляторные Т-лимфоциты, фенотип
ВВЕДЕНИЕ
Последние годы характеризуются резким нарастанием интереса к супрессорным популяциям Т-лимфоцитов, а число публикаций, посвященных этой проблеме, лавинообразно нарастает. Супрессорные Т-лимфоциты обеспечивают контроль периферической толерантности, ограничивают «коллатеральное повреждение» собственных тканей и осуществляют «негативную регуляцию» иммунного ответа, и разделяются на две группы: индуцированные и естественные (конституитивные) супрессоры. Индуцируемые супрессоры появляются в процессе иммунного ответа и анти-генспецифичны ^а-1-рестриктированные С08+СВ28- Т супрессоры, 1Ь-10-продуциру-ющие СБ4+СБ25- Тг1 и TGFP-продуцирую-щие СБ4+СБ25- ТкЭ лимфоциты). Естественные Т супрессоры ^КТ лимфоциты и СБ4+СБ25+ Т-регуляторные лимфоциты) формируются в ходе онтогенеза иммунной системы [8, 9]. Так, СБ4+СБ25+ Т-регуляторные лимфоциты (Трег) достигают в тимусе конечной стадии дифференцировки, поступают в кровь, заселяют лимфоидные органы, ре-циркулируют, способны к направленной
миграции в очаги воспаления, опухолевую ткань, трансплантаты [23], будучи одним из связующих звеньев между адаптивными и врожденными механизмами иммунитета. Стимулом для индукции антиген-неспецифической супрессорной активности Трег, является появление активированных СБ4+ хелпе-ров и контакт с ними [8, 16], однако тонкие механизмы инициации и реализации супрессорной активности пока не ясны. Фенотипи-чески СБ4+СБ25+ Трег характеризуются кон-ституитивно высоким уровнем экспрессии а-цепи рецептора к 1Ь-2 (CD4+CD25Bгight) [16]. Для CD4+CD25+ Трег лимфоцитов типична экспрессия и ряда других антигенов, — CD122 (а-цепь рецептора к 1Ь-2), GITR, СТЬА-4, CD62L, ТЬИ4, CD134, CD45RO, которые, однако, не являются уникальными для этих клеток [16, 18]. Супрессорная активность обусловлена наличием в Трег лимфоцитах транскрипционного фактора скурфина, продукта гена FoxP3 [7, 10], мутация которого приводит к тяжелым аутоиммунным расстройствам («curfy» мыши или 1РЕХ синдром у человека) [24, 25]. Количественная и функциональная недостаточность Трег рассматривается в числе возможных механизмов патогенеза ряда аутоиммунных и аллергических заболеваний [6, 11, 12, 22], а избыточная активность — фактором онкогенеза [22].
Адрес: 450093 Уфа, ул. Пушкина д. 54/1 кв. 58. E-mail: srgsib@mail.ru
Идентификация «ярко светящейся» части CD25 «позитивных» CD4+ Т хелперов (CD4+ CD25Bгi9ht)r даже в условиях двухпараметриче-ского окрашивания лимфоцитов, считается достаточно адекватным и надежным методом выявления Трег [3, 5]. Нормативные значения количества CD4+CD25Bгight у здоровых лиц, представленные в публикациях различных авторов, неодинаковы. Это связано, в том числе, с различными подходами к логическому ограничению пула Трег лимфоцитов. Следует отметить, что в ряде исследований аргументируется тот факт, что показатель содержания СБ4 + СБ25В"ды Трег лимфоцитов в крови имеет диагностическое и прогностическое значение, и в ряде ситуаций может быть использован для иммунологического мониторинга [5, 12, 13, 17]. Так, к примеру, для пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой характерно резкое возрастание содержания СБ4 + СБ25В"дм Трег лимфоцитов в периферической крови, для HCV инфекции, — снижение, а при HBV инфекции и циррозе печени их содержание в крови не изменяется [13].
В настоящей работе представлена количественная характеристика содержания CD4 + CD25Bгight клеток в периферической крови условно-здоровых доноров добровольцев.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Иммунологическое обследование проведено у 46 условно-здоровых доноров, которые добровольно дали согласие на участие в нем и были поставлены в известность о цели и задачах исследования. Группа состояла из 18 мужчин и 28 женщин. Обследуемые были разделены по возрастным группам: 20 — 40 лет (18 человек), 41 — 60 лет (19 человек) и более 60 лет (9 человек). Критериями включения в обследование были: 1) отсутствие на момент обследования острых инфекционных заболеваний; 2) отсутствие, по клинико-анамнестическим данным, инфекционного, аутоиммунного, аллергического и лимфо-пролиферативного иммунопатологических синдромов. У 14% доноров отмечались в анамнезе аллергические реакции эпизодического характера (острая крапивница) на пищевые продукты, косметические средства и лекарства. В возрастных группах 41—60 лет и более 60 лет наличие сердечно-сосудистых заболеваний (гипертоническая болезнь, ИБС) не явилось критерием исключения из исследования.
Взятие крови для иммунологического обследования (пункция локтевой вены) осуществляли в утренние часы строго натощак, кровь помещали в пробирку vacutainer, содержащую №2-ЭДТА (BD).
Использован стандартный метод прямого двухпараметрического иммунофлюоресцент-ного окрашивания и протокол лизиса — фиксации клеток (CellLyse/ CellFix, BD). Для оценки популяции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов использовали «парные» МКА антиCD3-FITC(IgG1)/антиCD4-PE(IgG1) (Immunoteck, Beckman Coulter) и соответствующий «изоти-пический» контроль (IgG1-FITC/IgG1-PE, IOTest). Для выделения границ лимфоцитар-ного региона использовали МКА антиCD45-FITC(IgG1)/антиCD14-PE(IgG1). Для идентификации CD4+ лимфоцитов, экспрессирую-щих а-цепь рецептора к IL-2, применяли FITC-меченые МКА против CD4 (IgG2a) (Caltag Lbs.) и меченые PE МКА против CD25 (IgG1) (Caltag Lbs.). Контрольные пробы инкубировали с FITC- и PE-мечеными иммуноглобулинами соответствующего изотипа (IgG2a - FITC/IgG1- PE, Caltag Lbs.).
Цитофлуорометрию осуществляли на проточном цитометре FACSCalibur (BD), при этом регистрировали суммарно не менее 10000 событий. Анализ данных осуществляли в рамках программы CellQuest (BD).
Статистическая обработка результатов произведена в рамках программного обеспечения Statistica для Windows (версия 6.0). В процессе анализа данных, в зависимости от характера распределения признака, использовали параметрические (межгрупповой критерий Стью-дента, Рт), и непараметрические (критерий Манна-Уитни, PM-U) критерии различия.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Стратегия логического ограничения (гейти-рования) CD4+CD25Bri9ht Трег
Выделение региона «ярко светящихся» CD4+CD25Bright Трег клеток среди популяции CD4+ лимфоцитов осуществляли, используя принцип, предложенный [3]. Авторы ограничивают только регион четко идентифицируемых «ярко светящихся» клеток в конце «шлейфа» CD4 CD25+ (CD4+ CD25Total) лимфоцитов (рис. 1). В отличие от предлагаемого авторами подхода (исключение «спорного региона» клеток и выделения CD4+CD25Low популяции лимфоцитов), что необходимо при сортировке клеток, всю оставшуюся популяцию CD4 + CD25+ лимфоцитов мы расценивали как «менее яркие» — CD4 + CD25Dim клетки.
Ъ-а
I
958.007
10° 101 102 103 Мойве ДОгаИТС
Ъ.
£
о
и
ю4
А1
958.008
С04+С1125ВпеЫ
СЕМ|СВ25Вш1
10° Ю1 102 Ю3 104 СБ4ИТС
£
о
и
о.
А2
958.008
СГН+СБ: 5В^Ы
семГ.
СХЙЯЭш!
10° 101 102 103 ю4
СВ4КТС
м
Си м
4п о
СЧ| т-Ч
а
и
В
341.008
СБ4+< югбВпгМ
СШ (-С0250ш1
10° ю1 ю2 ю3 ю4
СБ4ИТС
£ 6=!
СМ ,-н
О
и
918.008
СЮ4+С П25Вп§1и
ОТ41-С025Ит
10° 101 102 103 ю4
СБ4ИТС
о_
£
Л ^
N
а
о
Б
850.008
" ■! 'ИГт!
С134+
ПЙбВп^
:>■ СЕ14+СБ25Пш1
10° 101 102 103 104 СВ4ПТС
Рис. 1. Цитофлюорограммы в формате дот-плот, иллюстрирующие стратегию логического ограничения региона CD4 + CD25Bгight регуляторных Т клеток и примеры анализа популяций CD4 + CD25+ лимфоцитов у обследуемых. Верхний ряд — принцип логического ограничения: А — изотипический контроль, А1 — логическое ограничение регионов CD4 + CD25Bгight и CD4+CD25Low по принципу [3], А2 — логическое ограничение регионов CD4 + CD25Bгight и CD4 + CD25Dim1 примененное в настоящем исследовании. Нижний ряд: примеры анализа популяций CD4+CD25+ лимфоцитов у разных доноров
Содержание CD4+CD25BIight Трег в периферической крови условно-здоровых доноров в зависимости от пола и возраста обследуемых
Процентное содержание CD4+CD25Bгight Трег лимфоцитов в периферической крови группы доноров составило (М±8Б) 1,45±0,59% от всей популяции Т-лимфоцитов (таб. 1). СБ4 + СБ25Емды Трег клетки составили 3,30±1,39 % от всей популяции СБ3 + СБ4 + клеток и 7,00±3,01% от популяции СБ25, экс-прессирующих лимфоцитов, (СВ4 + СБ25Т°Ы). Характер распределения признака, характеризующего процентное содержание CD4 + CD25Bгight Трег лимфоцитов не отличался от нормального (рис. 2), коэффициент вариации (Су) составил 0,40, что характеризует данный показатель нормы, как «пластичный» [1]. Распределение значений абсолютного числа CD4 + CD25Bгight Трег клеток носило ассиметричный характер (коэффициент ас-симетрии 0,68, х2 = 6,41, Р < 0,01), что было обусловлено ассиметричным распределени-
ем показателя абсолютного числа всех лимфоцитов в периферической крови. Аналогичные закономерности распределения показателей прослеживались и для процентного и абсолютного числа всех CD25-позитив-ных CD4+ лимфоцитов (CD4+CD25Total) и популяции CD4+CD25Dim клеток.
Процентное содержание CD4+CD25Bгight лимфоцитов в периферической крови у женщин было несколько ниже, чем у муж
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.