ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ БИОЛОГИИ, 2007, том 68, № 2, с. 149-160
УДК 575.8-57.063
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ АМФИБИЙ РАЗНОГО ТАКСОНОМИЧЕСКОГО РАНГА ПО СПЕКТРАМ ОБЩИХ БЕЛКОВ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭСТЕРАЗ
© 2007 г. К. И. Чернышев1, К. Ä. Трувеллер2
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра зоологии позвоночных 119992 Москва, Ленинские горы e-mail: kir-ch@mail.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра зоологии беспозвоночных, лаборатория биологии развития животных 119992 Москва, Ленинские горы
e-mail: truveller@mail.ru Поступила в редакцию 07.02.2006 г.
По электрофореграммам в полиакриламидном геле водорастворимых общих белков (Pr) и неспецифических эстераз (Est) из разных тканей были получены оценки различия уровней внутривидовой дифференциации, а также таксонов видового и надвидовых рангов на представителях хвостатых (Triturus vulgaris vulgaris, T.v. lantzi, T. cristatus, T. montandoni, T. dobrogicus) и бесхвостых амфибий (Rana ridibunda, R. lessonae, R. temporaria, R. arvalis; Bufo bufo и B. viridis; Bombina bombina, Xenopus laevis, X. borealis, Hymenochirus boettgeri). Наиболее устойчивые значения генетических дистанций (D = -lnICS = —ln[2i/(2i + d)], где i и d- число фракций, идентичных и разных по Rf в паре сравнения) показали как по Pr, так и по Est скелетная мускулатура и глаз. По органам пищеварительной системы во многих случаях значения D были несколько выше, чем по другим органам и тканям. Генетические дистанции между разноранговыми таксонами получены по спектрам нескольких тканей и органов. Оценки дифференциации D внутри видов были выше у изученных представителей отряда Caudata (и по Pr, и по Est), что связывается с меньшей способностью к миграциям и большей консервативностью в выборе водоема для размножения у представителей этого отряда. На видовом уровне та же тенденция сохраняется для значений D, определенных по спектрам Pr. По спектрам Est ситуация обратная - видовой уровень дифференциации бесхвостых амфибий превышает таковой для хвостатых. Занижение оценок межвидовой дифференциации для хвостатых амфибий, по всей видимости, вызвано преобладанием в материале пар сравнений, относящихся к симпатрическим гибри-дизирующим видам тритонов.
Еще в 70-х годах XX в. было постулировано, что вследствие постоянной скорости мутирования структурных генов уровень генетической дивергенции таксонов возрастает с увеличением их ранга и в целом пропорционален времени, прошедшему с начала дивергенции (Ктига, 1968; 1975). Эта закономерность широко используется при выяснении рангов и филогении таксонов.
Нередко внешне схожие виды имеют существенные генетические различия. И напротив, процесс видообразования, приводящий к появлению морфологически различимых видов, в некоторых случаях протекает при низком уровне дивергенции по разным структурным генам тканей. Тогда генетические дистанции по частотам аллозимов не всегда могут служить надежной мерой времени генетической изоляции. Напротив, наблюдаемая дискретность значений коэффициентов дифференциации (особенно у беспозвоночных и низших позвоночных) разноранговых таксонов дала возможность полагать, что процесс видообразования состоит
из коротких в геологических масштабах периодов дивергенции, приводящей к образованию нового вида, и длительного, более или менее устойчивого существования вида как сложившейся генетической системы (Алтухов, 1997; Carson, 1975; Haag, True, 2001). Возможно, это отражает и существенные в видообразовании процессы изменения тканеспецифичности экспрессии структурных локусов, и роль регуляторных генов (Суходо-лец, 2000).
Однако часто опубликованные генетические дистанции вычислены для тех случаев, когда недостаточными оказываются морфологические или иного рода данные, т.е. для прояснения нетипичных случаев, когда зоолог сталкивается с тем, что затем получает название комплекса видов, полувида, вида в процессе становления, видов-двойников, крипти-ческих видов и т.д. Таким образом, часто обобщаются генетические дистанции не между "хорошими" видами или таксонами подвидового ранга, а
между группами неясного таксономического статуса.
Кроме того, на размытость оценок могут влиять несовершенство систематики некоторых групп и гибридизация. Поэтому даже в пределах семейства генетические дистанции нередко весьма вариабельны. Достаточно часто сравнение полученных генетических дистанций для проблемных групп с известными дистанциями между родственными хорошо изученными формами дает основания для изменения их таксономического статуса.
Источником ошибки в оценках генетических дистанций может быть использование, как это иногда делается, разных тканей или их соотношений в гомогенатах (нарушение синтекстности) при выяснении дифференциации между таксонами.
Решение такого рода проблем требует определения количественных границ дивергенции между таксонами в пределах изучаемой группы, так как, по всей видимости, неких универсальных границ не существует.
Таким образом, цель нашей работы - попытка установить возможные количественные границы дистанций между выбранными таксонами амфибий и прояснить закономерности, их определяющие. Для этого мы получили и сопоставили средние значения и размах изменчивости упрощенного коэффициента дифференциации D (Трувеллер, Абра-менко, 1990) для относительно хорошо изученных групп амфибий разного ранга, причем ранга, в систематике устоявшегося, а также исследовали достоверность и источники различий этих показателей. Второй задачей работы являлись оценка влияния выбора ткани или органа, взятых для анализа систем белков, на значения D таксонов (и, как следствие, скорости дивергенции разных тканей амфибий), их стабильность и возможность использования для дифференциации групп амфибий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для данного исследования служили ткани следующих представителей отряда Cau-data: сем. Salamandridae - Triturus vulgaris (Linne, 1758) (24 экз.), T.v. lantzi (Wolterstorff, 1914) (3 экз.), T. cristatus (Laurenti, 1768) (7 экз.), T. montandoni (Boulenger, 1860) (9 экз.), T. dobrogi-cus (Kiritzescu, 1903) (2 экз.); отряда Anura: сем. Ranidae - Rana ridibunda (Pallas, 1771) (4 экз.), R. lessonae (Camerano, 1882) (4 экз.), R. temporaria (Linne, 1758) (5 экз.), R. arvalis (Nilsson, 1842) (4 экз.); сем. Bufonidae - Bufo bufo (Linne, 1758) (2 экз.) и B. viridis (Laurenti, 1768) (4 экз.); сем. Dis-coglossidae - Bombina bombina (Linne, 1761) (4 экз.), сем. Pipidae - Xenopus laevis (Daudin, 1802)
(4 экз.), X. borealis (Parker, 1936) (4 экз.), Hy-menochirus boettgeri (Tornier, 1897) (1 экз.).
Сравнение между популяциями хвостатых амфибий проводили на примере тритонов из Закарпатской обл. Украины: T. vulgaris (Угля-1, Тячев-ский р-н (5 экз.); Мала Уголька, Тячевский р-н (11 экз.); окрестности замка Паланок, Мукачев-ский р-н (2 экз.)) и T. montandoni - (г. Кобыла, Ра-ховский р-н (4 экз.); Мала Уголька, Тячевский р-н (5 экз.)). В качестве внешней группы были взяты 6 экз. T. vulgaris у с. Троицкое Московской обл. Сравнение между популяциями бесхвостых амфибий проводили по выборкам большей численности на примере R. temporaria из трех локалите-тов Московской обл.: пруд дач "НИЛ" в низовье р. Малая Истра, ст. Н.-Иерусалимская Рижск. ж. д., Истринский р-н (37 экз.); два пруда Звенигородской биостанции МГУ у р. Москвы выше Лу-цино, Одинцовский р-н (40 и 8 экз.).
Проанализировали всего около 1500 электро-форетических спектров общих белков и неспецифических эстераз из 7 тканей от 190 экз. амфибий.
Водные экстракты для разгонки готовили из следующих тканей и органов: скелетной мускулатуры (у Caudata - фрагменты хвоста), глаза, печени, желудка и кишечника без прямой кишки (слизистая оболочка частично выскребалась при удалении содержимого), селезенки и яйцеводов. Образцы помещали в конические пробирки с 40%-ным раствором сахарозы (в соотношении объемов ~1:1) и хранили при -20°С. Замороженные фрагменты органов и тканей растирали шпателем в пробирках и оставляли на 1-2 ч при +4°С для более полной экстракции. Гомогенаты тканей центрифугировали при +4°С: бесхвостых амфибий - 50 мин при 3000 g, а хвостатых - 20 мин при 2500 g.
Вертикальный диск-электрофорез в параллельных блоках расщепленных пластин поли-акриламидного геля (Трувеллер, Нефедов, 1974) проводили в прерывистых системах с двумя катодными буферными растворами - трис-глициновым (Davis, 1964) и трис-ЭДГА-боратным (Peacock et al., 1965). Для верхнего концентрирующего геля (3% ПАА) использовали трис-фосфатный, трис-НС1, рН 8.3 или трис-ЭДТА-боратный, рН 8.6-9.0 буферные растворы. В нижнем разделяющем геле (трис-НС1-буфер, рН 8.3) последовательно применяли концентрации полиакриламида 7.5 и 9% для исключения случайного совпадения фракций по подвижности. Электрофорез проводили при +5-7°С, в концентрирующем геле с напряжением 100 V и в разделяющем геле при 200 V.
Неспецифическую окраску (на аминогруппы) фракций общих белков (Pr) проводили Coomassi G-250. На параллельных пластинах расщепленных блоков геля проявляли спектры неспецифических эстераз (Est; 3.1.1) с а-нафтилацетатом.
Идентификацию и сравнение подвижности фракций сканированных белковых спектров проводили при помощи программы TotalLab Ы у.2.01.
Чаще всего для оценки степени дивергенции таксонов по аллозимам используется коэффициент дифференциации Неи (генетическая дистанция по Неи, ВМе1) 1975), отражающий близость сравниваемых групп с учетом частот аллелей изученных локусов и по малым выборкам 1978). При использовании неспецифического окрашивания электрофоретических спектров общих и ферментных белков, особенно, для образцов смеси гомогенатов мелких особей, уместнее применение модифицированного коэффициента дифференциации: В = -1п1ст = -1п[27'/(27 + ё)], где ICS - коэффициент сходства Чекановского -Соренсена, 1 и ё - число фракций, идентичных и разных по Rf в паре сравнения (Батурин и др., 1984; Трувеллер, Абраменко, 1990; Трувеллер, Назарова, 1996; Тг^е11ег et а1., 1994). Таким образом, становится возможным количествен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.