ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 3, с. 326-334
УДК 577.21
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА КОМБИНИРОВАННОГО ЭФФЕКТА АЗОТНОГО СТАТУСА, СВЕТА И ДЕГИДРАТАЦИИ МИЦЕЛИЯ НА КОНИДИОГЕНЕЗ №игоБрога егаББа
© 2015 г. С. Ю. Филиппович*, Г. П. Бачурина*, Д. Л. Щербаков**
*Институт биохимии им. А.Н. Баха, Москва, 119071 **Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова, Москва, 119991 е-таИ^уШпЫ.газ.ги Поступила в редакцию 29.10.2014 г.
Проведена количественная оценка интенсивности образования спор у Ыеигозрога сгазза в ответ на обработку различными эффекторами конидиогенеза. В зависимости от источника азота и интакт-ности нитритредуктазы (НиР) и нитратредуктазы (НР), свет и дегидратация влияли на число жизнеспособных конидий, образованных аскомицетом. Совместное действие света и дегидратации в большинстве вариантов азотного статуса вызывало синергическое увеличение выхода конидий. Ко-нидиогенез в клетках дикого типа, выращенных на среде с МЫ4С1 в качестве единственного источника азота, был нечувствителен к свету, в то время как освещение культуры, выращенной на среде с МНфК03 или №N03, стимулировало процесс образования спор. Фотоответы пИ-2 (нет НР и НиР) и пИ-6 (нет НиР) мутантов на среде с NH4C1 были сходны, но сильно отличались на среде с NH4N03. Полученные результаты указывали на возможность участия НР и НиР в регуляции фотоконидиоге-неза (^?-штамм на среде с вторичным азотом), однако наличие НР и НиР не являлось необходимым элементом процесса, так как и у пИ-2 и пИ-6 мутантов наблюдалась светозависимая стимуляция образования спор.
Ключевые слова: конидиогенез, нитратредуктаза, нитритредуктаза, дегидратация, свет, азотный статус, Ыеигозрога сгазза.
БО1: 10.7868/8055510991503006Х
Конидиогенез (образование вегетативных спор, конидий) — это этап бесполого размножения в жизненном цикле мицелиальных грибов. Благодаря конидиогенезу происходит распространение репродуктивных структур гриба и обеспечивается выживание в неблагоприятных условиях внешней среды. Аскомицет Ыеигозрога сгазза — уникальный модельный микроорганизм для изучения морфогенеза грибов [1—5]. Смена фаз его развития (и образования спор, в том числе) находится под контролем определенных внешних факторов среды, некоторые из которых можно рассматривать как стрессорные воздействия.
Конидиогенез регулируется множеством факторов. Наиболее важными индукторами этого процесса являются недостаток источника питания, высушивание мицелия и свет. Взаимодействие этих факторов при спорообразовании у N. сгазза носит сложный характер. Так, в зависимости от доступности источника питания свет может действовать по-разному, ускоряя или тормозя определенные процессы. Ярким примером является влияние света на конидиогенез при углеродном и азотном голодании N. сгазза. Установлено, что синий свет стимулирует образование
конидий в поверхностной культуре в условиях голодания по углероду, но ингибирует в условиях голодания по азоту [6]. У других аскомицетов, Pénicillium camemberti и Trichoderma spp., морфологические особенности фотоиндуцируемого спорообразования могут определяться источником азота в среде [7, 8]. Следует учитывать, что различные пути сигнальной трансдукции у грибов, инициированные такими факторами как свет и компоненты среды роста, могут быть тесно переплетены в сложную сеть, имеющую петли с обратной связью [9].
Азотный статус организма определяет доступность различных источников азота и наличие в клетке ферментов, ассимилирующих эти источники. Мицелий штаммов дикого типа N. crassa способен использовать для роста как восстановленные источники азота (органические соединения и ионы аммония), так и окисленные формы — ионы нитрата. Выбор того или иного источника подчинен азотной метаболитной репрессии, т.е. ионы аммонийного азота репрессируют экспрессию генов ассимиляции нитрата и нитрита — нитратредуктазы (НАДФН:нитрат-оксидоредуктаза, КФ 1.6.6.3.; НР) и нитритредуктазы (НАДФН:нитритредуктаза,
Таблица 1. Штаммы N. crassa, использованные в исследовании
Штамм Утилизируемый источник азота nit Ген
wild type FGSC # 987 (74-0R23-1A) Нитрат, нитрит, аммоний Нормальное функционирование
nit-2 FGSC # 33 A Аммоний Кодирует специфическое связывание с ДНК белка, активирующего многие гены азотного метаболизма, НР и НиР отсутствуют
nit-6 FGSC # 3463 A Аммоний Кодирует НиР, НиР отсутствует, НР функционирует нормально
КФ 1.6.6.4.; НиР) [10, 11]. Присутствие в среде культивирования нитрата и нитрита, напротив, индуцирует синтез редуктаз, участвующих в ассимиляции нитрата [11, 12]. Роль НР и НиР в кони-диогенезе N. crassa представляет особый интерес, так как они являются ключевыми ферментами азотного метаболизма, определяющими соотношение нитрата и нитрита. Удобным инструментом для такого типа исследования является использование мутантов с нарушенным синтезом НР и НиР. Структурный ген nit-6 ответственен за синтез НиР у N. crassa [13]. У мутанта nit-6 отсутствует активность этого фермента, но присутствует активная НР, синтез которой индуцируется ионами нитрата в среде. Ген nit-2 — это глобальный регуляторный ген, кодирующий ядерный белок [14]. NIT-2 белок положительно влияет на экспрессию более 100 генов азотного метаболизма и участвует в азотной метаболитной репрессии в условиях недостатка восстановленных источников азота [14]. Повреждение гена nit-2 у мутанта полностью блокирует синтез и активность НР и НиР вне зависимости от состава источников азота в среде. Использование nit-мутантов в условиях индукции и репрессии ферментов позволило нам исследовать мицелий N. crassa, в котором активность НР и НиР варьировала в широким диапазоне.
Изучению фотоконидиогенеза у ряда мутантов N. crassa в условиях роста мицелия на средах с различными источниками азота было посвящено несколько работ Ниннеманн с соавт. [15—17]. Авторы предположили участие НР в фоторецепции при светоиндуцированном спорообразовании. Однако, гипотеза базировалась только на качественной оценке выхода конидий по плотности спор на фотографиях культур, без прямого учета количества сформировавшихся жизнеспособных конидий. Кристенсен с соавт. [18] показал возможность регуляции НР светом при исследовании другого светозависимого процесса у N. crassa — цир-кадных ритмов.
Способность другого фермента азотного метаболизма, НиР, участвовать в конидиогенезе была подтверждена данными об активации транскрипции гена нитритредуктазы при формировании конидий у аскомицета, Fusarium oxysporum [19].
Понимание механизма интеграции различных регуляторных сигналов конидиогенеза невозможно без количественной оценки его интенсивности в ответ на совместное и индивидуальное их воздействие.
Цель работы — оценить влияние внешних факторов среды (свет и дегидратация) на интенсивность конидиогенеза на фоне различного азотного статуса N. crassa на основе количественного подсчета жизнеспособных вегетативных спор.
МЕТОДИКА
Штаммы N. crassa. Штамм дикого типа wt 987 (74-0R23-1A) и мутанты nit-2 (33A) и nit-6(3463A) аскомицета N. crassa были получены из Центра по хранению генетического материала грибов (Fungal Genetic Stock Center - FGSC, США). Оба мутанта дефектны по НиР, а nit-2 штамм не обладал также НР (табл. 1).
Реагенты. Все реактивы для определения НР и НиР были получены от "Sigma-Aldrich" (США), другие использованные реагенты были химической степени чистоты от "Реахим" (Россия).
Получение инокулята и условия культивирования. Суспензию конидий получали по разработанному ранее методу [20] и хранили как иноку-ляционный материал при -70°C. Перед посевом суспензию разбавляли стерильной дистиллированной водой до концентрации 30 мг спор/мл (соответствует 106 конидий).
N. crassa культивировали как описано ранее [21]. Размороженную суспензию конидий, содержащую 0.25 мг спор/мл, равномерно распределяли шпателем по поверхности бислоя целлофан-бумажный фильтр (диаметр чашки Петри 9 см), покрывающего модифицированную среду Фогеля [22], с 2% агара. Модификация заключалась в том, что в качестве единственного источника азота использовали 50 мМ NH4Cl или 50 мМ NH4NO3, или 50 мМ NaNO3 вместо обычно применяемого 25 мМ NH4NO3.
Стимуляция конидиогенеза светом. После 24 ч роста при 28°C в темноте (в черных хлопчатобумажных мешках) мицелий N. crassa освещали в течение 2 ч люминесцентными лампами ЛДЦ-36 W
("ВНИИС-Лисма", Россия) при интенсивности 15 Вт м-2. Затем освещенные и контрольные (тем-новые) чашки Петри инкубировали при 28°С в течение 24 ч в темноте. Для оценки интенсивности конидиогенеза конидиальную суспензию собирали, добавляя 5 мл дистиллированной воды на каждую чашку. Серию последовательных разведений (1 : 100, 1 : 1000 и 1 : 10000) полученной суспензии спор использовали для высева на агаризо-ванную среду Фогеля, содержащую 1% сорбозы и 0.1% глюкозы в качестве источника углерода, а также 4 мМ NH4C1 в качестве источника азота. После 2 сут инкубации в тех же условиях подсчитывали число образовавшихся колоний, соответствующее количеству жизнеспособных конидий, и нормализовали на 1 см2 поверхности чашки Петри.
Влияние дегидратации мицелия на конидиоге-нез. Для изучения влияния дегидратации мицелия проводили сравнение образования конидий на гидратированной и негидратированной культурах N. сгазза. Гидратирование проводили на 24-часовом мицелии, путем добавления 1 мл стерильной дистиллированной воды под бислой целлофан-бумажного фильтра при красном свете и инкубирования в течение 10 мин в темноте при 28°С. Затем опыт проводили, как описано выше.
Получение диализатов экстрактов мицелия. Освещенный и контрольный (темновой) мицелий N. сгазза собирали при красном свете, промывали дистиллированной водой, фильтровали через 2 слоя марли, высушивали при помощи фильтровальной бумаги, взвешивали и фиксировали жидким азотом. Полученные образцы хранили при —70°С. Замороженный мицелий разрушали растиранием в ступке с жидким азотом в течение 15 мин.
Экстракцию проводили при слабом перемешивании в течение 30 мин 5 объемами 0.1 М К-фос-фатного буфера рН 7.2, содержащего: 2 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотрейтол, 1 мМ фенилметилсульфо-нилфторид и 1%-ный №С1. Полученный эк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.