ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.12+577.112.6
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ ОБОГАЩЕННОГО ПРОЛИНОМ ГИПОТАЛАМИЧЕСКОГО
ПОЛИПЕПТИДА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС © 2014 г. С. С. Абрамян1, *, Т. К. Давтян2, А. Р. Хачатрян1, Н. В. Тумасян1,
И. К. Саакян1, А. А. Арутюнян1, С. Г. Чаилян 1, |А. А. Галоян|'
Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна Национальной Академии наук Республики Армения, Ереван 2Исследовательский центр "Арменикум", ООО "Арменикум", Лаборатория иммунологии и вирусологии,
Ереван, Республика Армения
Обогащенный пролином полипептид (ПП-1), состоящий из 15 аминокислотных остатков (AGAPEPAEPAQPGVY), является регуляторным гипоталамическим пептидом, обладающим ней-ропротекторными, иммуномодулирующими, гемопоэтическими и антибактериальными свойствами. С целью количественного определения его содержания в крови крыс был применен метод им-муноферментного анализа с использованием поликлональных антител, полученных против синтетического препарата пептида, получившего название "Галармин". Показано, что минимальный уровень ПП-1 в сыворотке крови интактных крыс составляет 1.78 нг/мл. Значительное увеличение количества ПП-1 в образцах крови наблюдалось через 5 ч после внутрибрюшинного введения препарата, однако, через 2 суток постинъекционного периода содержание ПП-1 в крови снижалось, приближаясь к контрольному уровню, что может быть результатом протеолитического расщепления пептида.
Ключевые слова: обогащенный пролином полипептид, иммуноферментный анализ, антитела, сыворотка крови, крыса.
DOI: 10.7868/S1027813314010026
ВВЕДЕНИЕ
Обогащенные пролином пептиды, полученные А.А. Галояном и сотрудниками из нейросек-реторных гранул гипоталамуса и нейрогипофиза крупного рогатого скота, образуются из единого белка-предшественника [1, 2]. Один из них, ПП-1 (Галармин) характеризуется многообразием проявлений биологической активности. Он обладает иммуномодулирующим и нейропротекторным свойствами [3], являясь ингибитором активности каспазы-3 и -9, активатором каспазы-2 и -6 [4], стимулятором иммунокомпетентных клеток (Т и В лимфоцитов и макрофагов) [5, 6], индуктором синтеза интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-6) и фактора некроза опухоли альфа в фибробластах, макрофагах, астроцитах, лимфоцитах, регулятором мие-ло- и лимфопоэза [6—9], нейропротектором от многих эндогенных токсинов. Он также проявляет мощный противомикробный и противовирусный эффекты [6—11] и нейротрофическое дей-
*Адресат для корреспонденции: 0014 Армения, Ереван, ул. П. Севака, д. 5/1, тел.: (374-10) 61-53-01, факс: (374-10) 29-73-43, e-mail: silva@dolphin.am.
ствие на синтез глиального фибриллярного кислого белка в астроцитах [12]. Более того, ПП-1 предотвращает нейродегенерацию, вызванную воздействием ядов животных, в частности, змеиных ядов [9, 13—15], а также травмами нервной системы, например, в результате гемисекции спинного мозга (СМ) [16, 17] и интоксикации Р-амилоидом [18], или алюминием [19]. ПП-1 относится к числу природных биологически активных пептидов — ингибиторов протеинкиназ [20].
В наших предыдущих иммуногистохимиче-ских исследованиях действия ПП-1 на восстановительные процессы ежедневное введение животным ПП-1 в течение 3-х недель после гемисек-ции СМ [16] вызывало значительное увеличение количества ПП-1-иммунореактивных нервных клеток и волокон в паравентрикулярном (ПВЯ) и супраоптическом (СОЯ) ядрах [13, 21].
Присутствие ПП-1-иммунореактивных нервных структур в различных группах клеток, включая ПВЯ и СОЯ гипоталамуса, продолговатого мозга и мозжечка, а также СМ, свидетельствует о том, что источником происхождения ПП-1 является нервная система [21]. Наличие ПП-1 в спе-
циализированных эпендимных (глиальных) клетках третьего желудочка — таницитах и их ответная реакция на инъекцию ПП-1 указывают на то, что данный пептид может быть вовлечен в регуляцию гематоэнцефалического барьера. Можно полагать, что наряду с нейротрансмиттерами (нейро-пептидами, биогенными аминами) ПП-1 способен стимулировать высвобождение гормонов гипофиза. Не исключается также поступление ПП-1 в аденогипофиз из гипоталамуса через портальные сосуды в качестве одного из рилизинг-гормонов мозга.
Активация иммунореактивности ПП-1 в некоторых областях головного мозга, включая гипоталамус и ствол мозга, была продемонстрирована через 5 ч после однократной инъекции ПП-1, что может препятствовать высвобождению эндогенного ПП-1 из ядер гипоталамуса и приводить к его накоплению в структурах мозга. Кроме того, возможен синтез ПП-1 в нейронах этих структур [16].
Процесс высвобождения пролин-содержащих нейропептидов и гормонов из предшественников и их распад осуществляется специфическими протеазами [22, 23]. Дипептидилпептидазы (ДПП) составляют семейство сериновых протеаз, которые удаляют Х-Рго и Х-А1а дипептиды с Оконца субстрата [24]. ДПП-1У (Е.С. 3.4.14.5) является наиболее распространенным и интенсивно изучаемым членом семейства ДПП [25, 26], субстратами которого являются хемокины, гормоны, нейропептиды, факторы роста. Недавно было обнаружено, что ПП-1 представляет собой новый природный субстрат для ДПП-1У [27].
Целью данного исследования было выявление и количественное определение содержания ПП-1 в образцах сыворотки крови интактных крыс и крыс, подвергнутых внутрибрюшинным инъекциям ПП-1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании были использованы белые лабораторные крысы-самцы массой 200—250 г, которые были разделены на 3 группы. К группе 1 отнесены интактные крысы (п = 5); к группам 2 и 3 отнесены крысы, подвергнутые внутрибрюшин-ным инъекциям ПП-1, в сыворотке крови которых определяли содержание пептида через 5 ч (п = 5) и через 2 дня (п = 5) соответственно после введения ПП-1 (5 мкг/100 г). Образцы сыворотки крови брали у интактных и у экспериментальных животных.
Для выявления и количественного определения ПП-1 в образцах сыворотки крови был применен разработанный нами метод иммунофер-ментного анализа (ИФА) для данного пептида с
использованием поликлональных антител против синтетического ПП-1.
Получение антисыворотки к ПП-1. Антисыворотку против синтетического ПП-1 получали с использованием кроликов Шиншилла путем иммунизации ПП-1 [28], конъюгированного с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и смешанным с полным адъювантом Фрейнда для получения гомогенной эмульсии [29]. Животные были иммунизированы этой эмульсией в равных порциях в подколенные лимфоузлы. Иммунизацию повторяли через 1 месяц, инъецируя свежеприготовленную эмульсию в левый подколенный лимфоузел, внутримышечно (с правой стороны) и в ушную вену. После иммунизации образцы крови брали из ушной вены на 7-й, 9-й и 11-й дни. Специфичность антисыворотки была тестирована иммунодиффузией и методом ИФА.
Конкурентный ИФА, используемый для обнаружения ПП-1 в сыворотке крови крыс. Для определения содержания ПП-1 в образцах крови крыс были выбраны следующие оптимальные условия: количество иммобилизированного на планшетах ПП-1 — 25 нг/мл; кроличьи первичные антитела против синтетического ПП-1 использовали в разведении 1 : 5000; анти-кроличьи вторичные антитела, конъюгированные с биотином — в разведении 1 : 10000; экстравидин, конъюгированный с пероксидазой — в разведении 1 : 10000. В лунки планшетов для ИФА (VWR Scientific, Mississauga ON) добавляли по 100 мкл ПП-1 в концентрации 25 нг/мл в карбонатном буфере (15 мМ Na2CO3, 35 мМ NaHCO3) и инкубировали в течение ночи. Планшеты промывали 3 раза фосфатным буфером, содержащим 0.1%-ный Твин-20, затем инкубировали 1 ч в блокирующем буфере (1% БСА в фосфатном буфере), по 200 мкл/лунку с целью предотвращения неспецифического связывания. По окончании инкубации планшеты промывали 5 раз буфером.
Дальнейшую инкубацию осуществляли следующим образом: 50 мкл серийно двукратно титрированного стандартного раствора ПП-1 с начальной концентрацией 25 нг/мл или образцы крови (концентрированные и разбавленные в отношении 1 : 1, 1 : 2 и 1 : 4) смешивали с 50 мкл антисыворотки (1 : 2500) для получения конечного разведения (1 : 5000) и в каждую лунку добавляли по 100 мкл.
Для определения максимального связывания (Bmax) использовали антисыворотку без добавления ПП-1, после чего проводили инкубацию в течение 90 мин при комнатной температуре в присутствии биотинилированных козьих антикроличьих вторичных антител (1 : 10000) по 100 мкл/лунку. После промывания буфером в лунки добавляли
по 100 мкл экстравидина, коньюгированного с пероксидазой хрена, разведенного ФБ (1 : 10000) и инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре. Затем в лунки добавляли по 100 мкл субстрата (8 мг ортофенилендиамин, 12 мл цитра-того буфера и 5 мкл 30% H2O2) и инкубировали в течение 30 мин в темноте. Реакцию останавливали 1 N H2SO4 (50 мкл/лунку). Расчет оптической плотности (ОП) проводили на многоканальном спектрофотометре при длине волны 450 нм.
Следует отметить, что данные, полученные при изучении цельной сыворотки крови после центрифугирования в течение 15 мин при 1500 об./мин, оказались вариабельными и не поддавались статистической обработке. Поэтому нами были использованы низкомолекулярные фракции пептидов, полученные путем осаждения высокомолекулярных белковых фракций метанолом. Для этого к 100 мкл сыворотки крови добавляли 400 мкл метанола и центрифугировали эту смесь в течение 10 сек при 9000 об./мин. В дальнейшем, для выявления и количественного определения ПП-1 в крови крыс нами были использованы образцы фракций низкомолекулярных пептидов.
Статистический анализ. Полученные результаты были проанализированы при помощи статистических пакетов GraphPadPrism version 3.03 и SPSS 11. При необходимости данные были преобразованы. Полулогарифмическая стандартная кривая была получена с использованием нелинейной регрессии. Была выявлена минимальная концентрация при анализе исследуемых образцов сыворотки крови. Сравнительный анализ проводили с помощью критерия Крускала—Уоллиса для множественных сравнений с парным тестом Манна—Уитни, при возможности их применения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Определение оптимального разведения крови.
Калибровочная кривая конкурентного ИФА получена путем построения зависимости средних ли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.