ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 1, с. 58-67
= ЭКОЛОГИЯ =
УДК 57.02:579.262:579.841.11
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАЗВИТИЯ СООБЩЕСТВА ДИССОЦИАНТОВ Pseudomonas aeruginosa
© 2007 г. П. В. Фурсова, Ä. П. Левич
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
119992 Москва, Ленинские горы E-mail: fursova@biophys.msu.ru Поступила в редакцию 22.12.2005 г.
Стационарная стадия накопительной культуры диссоциантов бактерий Pseudomonas aeruginosa описана с помощью вариационной модели потребления и роста. В качестве целевой функции использован функционал "обобщенной энтропии". Параметрами модели являются потребности диссоциантов в основных питательных веществах: углероде, азоте и фосфоре. На основе вариационной модели рассчитаны области лимитирования для различных комбинаций начальных запасов ресурсов и состав сообщества микроорганизмов на стационарной стадии роста как функция ресурсов, ограничивающих рост. Продемонстрировано соответствие экспериментальных данных и модельных расчетов. Обсужден вопрос возможности управления структурой сообщества.
Среди современных проблем биологии центральное место занимает проблема адекватного экологического прогноза. В приложении к экологии сообществ, в частности микробиологических, она может быть переформулирована как проблема строгого количественного предсказания (расчета) численностей видов, образующих сообщество, как функций, аргументами которых являются факторы, определяющие жизнедеятельность организмов. Среди таких факторов одно из первых мест занимает обеспеченность особей ресурсами среды. Критерием адекватности расчетных схем может служить умение управлять структурой сообщества или, другими словами, умение поддерживать необходимый состав сообщества, представленного группами организмов в необходимых пропорциях. Интерес к подобным прикладным задачам связан с тем, что параметры биологических процессов и урожай продуцируемых веществ сильно зависят от доли, которая в биомассе сообщества приходится на те или иные виды организмов. Особая ситуация в микробиологических биотехнологиях возникает из-за явления диссоциации микроорганизмов. При этом активность диссоциантов, их физиологические особенности, влияющие на продуцирование биологически активных веществ, различны, что приводит к необходимости контролировать состав возникающей поликультуры.
Для исследования возможностей описания микробиологических культур с точки зрения проблем прогноза и управления нами использована вариационная модель потребления и роста для экологических сообществ (Levich, 2000; Левич и др., 1994). Эта модель позволяет по известным потребностям физиологически различающихся
групп организмов рассчитывать как области лимитирования для любых сочетаний ресурсных факторов в среде, так и численности популяций сообщества на стационарной стадии роста как функции лимитирующих рост ресурсов. Подход, лежащий в основе вариационной модели, берет свое начало в классической статистической физике, в которой каноническое распределение (стационарное состояние идеального газа) получается решением задачи на максимум энтропии при условии, что задана средняя энергия газа. В рамках используемой модели стационарное состояние сообщества микроорганизмов описывается решением задачи на условный экстремум функции обобщенной энтропии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Проведенное исследование состояло из следующих основных этапов. Сначала были получены явные формулы для расчетов границ областей лимитирования и численностей групп клеток в тех ситуациях, которые имеют место в лабораторных экспериментах. Затем был проведен анализ чувствительности модели к изменению ее параметров, что позволило судить о степени согласованности теоретических и экспериментальных результатов. По результатам лабораторных экспериментов с монокультурами были определены параметры модели, которые представляют собой потребности микроорганизмов в основных питательных веществах. Затем, основываясь на данных опытов по экспериментальному определению ресурсов, ограничивающих рост сообщества (так называемые опыты с добавками), как для моно-, так и для смешанных культур, было прове-
рено соответствие предсказываемых теоремой стратификации лимитирующих ресурсов экспериментальным данным. И, наконец, для различных вариантов поликультур (для всех попарных смесей и смеси трех диссоциантов) проведена проверка адекватности теоретических расчетов состава сообщества на стационарной стадии роста результатам опытов.
Объектом работы были R-, S- и М-диссоциан-ты бактерий Pseudomonas aeruginosa. Диссоциативные переходы бактерий, или вариация фаз, вносят важнейший вклад в создание гетерогенности бактериальной популяции (Милько, Егоров, 1991). Они обусловлены геномными перестройками, которые происходят с высокой частотой, превышающей частоту случайных мутаций на несколько порядков, и обладают плейотропным действием. Это определяет постоянные и обратимые изменения многих морфологических и фи-зиолого-биохимических свойств клеток: способность к деградации и синтезу практически ценных веществ, устойчивость к внешнему воздействию, скорость роста (Милько, Мартынкина, 1996), потребность в питательных веществах. В настоящее время диссоциативные формы обозначают символами согласно некоторым морфологическим признакам их колоний: S (smooth) - гладкие, R (rough) - шероховатые, М (mucoid) - слизистые. Представители рода Pseudomonas широко используются в различных биотехнологических процессах: в химических производствах, в биогидрометаллургии, в производстве химических препаратов для сельского хозяйства, при получении полимеров, для повышения нефтеотдачи пластов, при переработке и удалении отходов и веществ, загрязняющих среду, в том числе нефтяных загрязнений (Калакуцкий и др., 1996; Мордухова и др., 2000).
Всего для расчетов были использованы данные наших с соавторами экспериментов: 152 эксперимента по выращиванию монокультур и 77 -смешанных (попарных комбинаций диссоциантов и смеси всех трех) (Милько, Ильиных, 2001; 2004; Фурсова и др., 2004а, б; 2005). Микроорганизмы помещали в замкнутую среду, содержащую различные компоненты питания, необходимые для развития. В процессе развития культуры, включающем в себя деление клеток и их гибель, не производили добавления или изъятия ресурсов и микроорганизмов каким-либо искусственным способом. При таком росте сообщество развивалось до наступления стационарной фазы. Продолжение культивирования приводило после некоторого времени пребывания в стационарной фазе к естественной деградации сообщества (фаза отмирания).
Сообщества псевдомонад выращивали на средах с различными начальными содержаниями углерода, азота и фосфора методом накопительного культивирования. Эти вещества необходимы
для роста и являются взаимонезаменимыми. В процессе роста проводили измерения оптической плотности культуры, уровня кислотности среды, в некоторых опытах контролировали химический состав среды. В том числе пользовались полуколичественными экспресс-методами определения глюкозы, нитратов и фосфатов.
Для определения количества клеток в культуре на стационарной стадии развития для каждого дис-социанта был получен коэффициент, связывающий оптическую плотность с численностью клеток.
Соотношение диссоциантов в популяции определяли по морфологии колоний рассевом на плотную среду, содержащую мясо-пептонный бульон и сусло в равных отношениях.
Для экспериментального определения ресурса, ограничивающего рост культуры, проводили так называемые опыты с добавками. В момент предполагаемого достижения стационарной стадии культуру разделяли на четыре пробирки. В три из них вносили добавки - глюкозу, нитрат или фосфат, а четвертую оставляли без изменений (контроль). В других опытах для проверки возможности многофакторного лимитирования вносили не три, а семь возможных комбинаций добавок - каждое вещество в отдельности, их парные комбинации и все три ресурса. Количество добавляемых веществ равнялось их первоначальному содержанию в среде. Культуру оставляли расти в различных опытах на срок от 4 до 12 ч, затем проводили измерение оптической плотности. Если добавление компонента питания в среду приводило к возобновлению деления клеток, то этот ресурс считали лимитирующим. В случае если внесение вещества не приводило к росту культуры, считали, что этот фактор не ограничивает развитие сообщества.
Если условия культивирования и измерений не соответствовали предпосылкам используемой в работе модели, данные эксперимента исключали из дальнейшего рассмотрения.
Вариационное моделирование роста и потребления для сообщества микроорганизмов. Стационарная стадия развития сообщества, состоящего из м> групп микроорганизмов, которые потребляют т взаимонезаменимых ресурсов, может быть описана решением следующей вариационной задачи на условный экстремум (Levich, 2000; Левич, 1982; Левич и др., 1994; 1997; Левич, Алексеев, 1997):
H(Щ, ... ,nw) =
XЧкгЩ ^ Lk, k = 1, m; i = 1
ni > 0, i = 1, w.
w w
X ni In X ni
Vi = 1 Vi =1 /
w
Здесь «г- - искомая численность каждой из групп клеток сообщества на стационарной стадии роста; - потребляемое из среды количество к-го ресурса, необходимое для деления клетки группы 1, в расчете на одну клетку, или потребность организма группы 1 в ресурсе к (предполагается выполнение равенства гапЦ ) = тт(т; w), что обеспечивает различимость групп клеток); Ьк - содержание ресурса к в среде в начале культивирования (Ьк > 0); w - количество групп микроорганизмов, образующих сообщество; т -количество потребляемых взаимонезаменимых ресурсов. В качестве целевой функции Н использован так называемый функционал обобщенной энтропии, а ограничения отражают конечность запасов потребляемых ресурсов. Важно отметить, что функционал Н не постулирован, а выведен на основе категорно-функторного метода сравнения математических структур (Левич, 1982; Levich, Solov'yov, 1999). Само сообщество описано математической структурой множеств из п элементов, разбитых на w непересекающихся
классов размером п, (п = ! П). Допустимыми
преобразованиями для этих объектов являются
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.