МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 5, с. 696- 704
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.262:579.22.51
КОЛОНИЗАЦИЯ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ БАКТЕРИЯМИ АгОБРШНиИ ВВАЗИЕЖЕ С РАЗЛИЧНОЙ ПОДВИЖНОСТЬЮ
© 2010 г. А. В. Шелудько1, А. А. Широков, М. К. Соколова, О. И. Соколов, Л. П. Петрова,
Л. Ю. Матора, Е. И. Кацы
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов Поступила в редакцию 06.07.2009 г.
Миграция ассоциативных бактерий АяэзртИит Ъгаяйете по полужидким средам осуществляется преимущественно посредством роения фенотип), зависящего от работы жгутиков и межклеточных контактов. Для лишенных полярного жгутика и нероящихся мутантов штамма А. Ъгаяйете Зр245 характерно распространение в полужидких средах с образованием микроколоний (Оп+ фенотип), механизм которого не ясен. Изучение динамики колонизации корней проростков пшеницы показало, что у Оп+ мутантов А. ЪгаяИете Зр245 снижена способность к адсорбции на корнях пшеницы. Однако после "заякоривания" штамм А. ЪгаяИете Зр245 и его З^а- Оп+ мутанты заселяют растущие корни практически с одинаковой эффективностью. Все исследованные штаммы образуют на поверхности корня микроколонии, стимулируют образование разветвленных корней и демонстрируют изменение содержания экспонированных белковых антигенов. Получены косвенные данные о том, что в процессе адаптации к существованию на корнях растений у штамма А. ЪгаяИете Зр245 активизируется продукция родоспецифических белковых антигенов.
Ключевые слова: Ауэ8рт11ит Ъга8Иете, подвижность, колонизация растений, антигены, иммунофлуорес-центная микроскопия, иммуноферментный анализ.
Бактерии Azospirillum brasilense обладают несколькими механизмами социальной подвижности, потенциально важными для формирования ассоциаций с растениями. Азоспириллы плавают в жидких средах с помощью одиночного полярного жгутика (Fia). При колонизации полужидких сред они распространяются в виде потоков роящихся бактерий (Swa+ фенотип, от англ. swarming — роение), используя Fia и многочисленные латеральные жгутики (Laf) [1, 2]. Клетки A. brasilense могут перемещаться в полужидких средах и с образованием зернистых скоплений (микроколоний) (Gri+ фенотип, от англ. granular inclusions — зернистые включения) [3—5]. Возможно, Gri+ распространение зависит от полярного пучка пилей, изредка встречающегося на клетках A.. brasilense вместо полярного жгутика [3]. У мутантов с нарушениями продукции или работы полярного жгутика Gri+ фенотип стабилен [2, 3, 5], а их производные с восстановленной продукцией полярного жгутика опять начинают роиться [5]. Ранее нами было показано, что корневые экссудаты пшеницы: стимулируют роение штамма A. brasilense Sp245 [5], а присутствие в среде культивирования агглютинина зародышей пшеницы способствует переходу части популяции штамма Sp245 к микроколониальному распространению [4].
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: shel71@yandex.ru).
Способность азоспирилл перемещаться в почве по направлению к корням растения и наличие у них чувствительной системы хемотаксиса, "настроенной" на определенные компоненты экссудатов предпочтительного партнера, обусловливают заселение бактериями растений [6—8]. Особенности процесса формирования биопленок A. brasilense на поверхности корней растений практически не изучены. Получены данные о начальных этапах колонизации азоспириллами корневой системы растений — адсорбции и "заякоривании" клеток. Показано, что полисахариды, белки с лектиновой активностью и полярный жгутик опосредуют первые этапы взаимодействия бактерий с поверхностью корня [9—14]. Однако механизмы подвижности, позволяющие клеткам A. brasilense после закрепления на поверхности корня сформировать биопленку, и относительный вклад в этот процесс разнообразных полимеров клеточной поверхности у A. brasilense не известны.
Целью данной работы явился сравнительный анализ динамики колонизации корней растений и изменений в антигенных детерминантах клеточной поверхности in planta у штамма A. brasilense Sp245 и его оригинальных мутантов по социальной подвижности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и условия культивирования бактерий. В
работе использовали штамм A. brasilense Sp245, выделенный из корней пшеницы [15], и его Swa- Gri+ мутанты (KmR): Fla- SK048, Fla- Laf- SK051 и Fla-leaky Laf- SK454 [2, 3]. Мутанты содержат вставку искусственного транспозона Omegon-Km (SK048, SK454) или вектора для мутагенеза pJFF350 (SK051) в хромосоме (SK454) или плазмидах с молекулярной массой 85 МДа (SK051) и 120 МДа (SK048) [2, 16].
Бактерии выращивали на малатно-солевой среде (MSM) [17] и среде Luria-Bertani (LB) [18] при 30°С. При необходимости в среды добавляли канамицин (Km) до конечной концентрации 50 мкг/мл.
Инокуляция растений бактериями. Семена мягкой яровой пшеницы сорта Саратовская 29 (ВНИИСХ Юго-Востока РАСХН, Саратов) стерилизовали и проращивали в течение 3 сут как описано в работе [9]. Инокуляцию растений проводили, выдерживая проростки при покачивании (25 об/мин) в суспензии бактерий (А590 = 0.5) в 50 мМ фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7.2). Для приготовления суспензий использовали 12-часовые культуры бактерий, выращенные в жидкой MSM и отмытые от среды PBS. Через 3 ч проростки пшеницы однократно промывали стерильным PBS и помещали над слоем жидкости в пробирки, содержащие 10 мл среды для растений следующего состава (г/л): KH2PO4 - 4, CaCl2 - 1.25, H3BO3 - 0.0016, CuSO4 • 5H2O - 0.028, MgSO4 - 0.09, Na2MoO4 • 2H2O - 0.0025, KJ - 0.008, ZnSO4 - 0.015, FeSO4 • 7H2O - 0.028, этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль - 0.037 (рН 6.0). Растения выращивали 7 сут при 22°С и естественном освещении. Распределение бактериальных клеток на корнях определяли с использованием фазово-контраст-ного микроскопа Jenaval и флуоресцентного микроскопа DMLB ("Leica", Германия).
Определение численности бактерий на корнях проростков пшеницы. Из навесок стерильно отмытых корней трехдневных и 10-дневных проростков готовили гомогенат, в котором определяли количество колониеобразующих единиц (КОЕ) посредством высевов серийных разведений на плотную MSM. Количество бактерий, высеваемых с корней, пересчитывали на одно растение. Параллельно го-могенаты корней использовали для иммунофер-ментного анализа (ИФА) (см. ниже). Для контроля посторонней микрофлоры дополнительно проводили высевы разведений гомогенатов корней на LB без антибиотиков и LB с канамицином. В последнем случае контролировали наличие посторонней микрофлоры, так же, как и мутантов, устойчивых к канамицину. Если при высевах на обогащенную среду встречались колонии с нехарактерной для азоспирилл морфологией, соответствующие образцы корней отбрасывали.
Антитела, использованные в работе. Штаммоспе-цифичные антитела (Ат) на полисахаридные антиге-
ны A. brasilense Sp245 (Ат1) и Sp7 (Ат3) получены как описано ранее [19]. Для выявления поверхностных родо/видоспецифичных белковых антигенов использовали поликлональные Ат, полученные на ин-тактные клетки А. brasilense Sp7 (Ат2). Данные Ат распознают весь пул поверхностных антигенов Sp7 и взаимодействуют с белковыми антигенами штамма Sp245, но не с его полисахаридными детерминантами [19]. Концентрация Ат1—Ат3 во всех экспериментах составляла 50 мкг/мл. Вторичными антителами являлись козьи антикроличьи Ат, конъюгиро-ванные с пероксидазой хрена ("Sigma"), и ослиные антикроличьи антитела, конъюгированные с флуо-ресцеинизотиоцианатом (ОААТ-ФИТЦ) (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва).
Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ. Для ИФА заселенные бактериями или стерильные (контроль) гомогенаты корней разводили PBS в 80 раз (оптимальные разведения образцов были подобраны нами экспериментально) и вносили по 50 мкл разведений в лунки полистирольных 96-лу-ночных планшетов. Выдерживали в течение 30 мин на виброшейкере при комнатной температуре, затем стационарно в течение 18 ч при 4°С. Дальнейший анализ проводили согласно рекомендациям, описанным нами ранее [20]. Бактериальные полисаха-ридные или белковые антигены выявляли, используя Ат1 или Ат2 соответственно. Конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антикроличьи Ат использовали в концентрации 1 мкг/мл. Выявление пероксидазной активности проводили в 0.1 М на-трий-цитратном буфере (рН 4.5) с добавлением 0.03% о-фенилендиамина и 0.02% перекиси водорода. Оптическую плотность (А490) исследуемых проб определяли на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С (ЗАО ИЛИП, Санкт-Петербург). Аналогичным образом проводили ИФА бактериальных культур. В последнем случае дважды отмытые PBS бактериальные суспензии (А590 = 0.4) разводили в 100 раз и вносили по 50 мкл в лунки планшетов.
Флуоресцентная микроскопия корней проростков пшеницы. Проростки однократно отмывали PBS (5 мин), корни нарезали на фрагменты длиной 10— 15 мм. Блокировку неспецифических сайтов связывания проводили 0.05% раствором полиэтиленгли-коля 2000, через 10 мин наносили Ат1 или Ат2 в концентрации 50 мкг/мл. По истечении 20 мин корни трижды отмывали PBS (5 мин). Затем наносили ОААТ-ФИТЦ в концентрации 100 мкг/мл. Через 15 мин дважды отмывали PBS (5 мин). Регистрацию результатов осуществляли с помощью микрофото-насадки MPS 60 ("Leica", Германия). В качестве контроля использовали стерильные корни, а также корни инокулированных проростков, обработанных "холодными" Ат3 или только ОААТ-ФИТЦ.
Двумерный иммуноэлектрофорез. Для получения экстрактов наружных мембран бактерии точечно инокулировали в полужидкую MSM (0.4% агара).
Таблица 1. Влияние инокуляции культурами А. ЪтшИете на рост проростков мягкой яровой пшеницы сорта Саратовская 29
Характеристика проростков через 7 сут после инокуляции
Штамм A. brasilense Корни Надземная часть
Длина, мм Разветвленные корни, % Длина, мм
Sp245 SK048 SK051 SK454 Контроль без инокуляции 49.8 ± 5.6 52.8 ± 7.2 57.4 ± 8.0 51.1 ± 7.2 55.1 ± 7.2 65.7 ± 7.1 63.0 ± 5.6 63.1 ± 10.0 62.3 ± 10.9 44.6 ± 5.4 122.1 ± 14.4 123.5 ± 15.2 122.4 ± 15.9 118.3 ± 20.6 115.2 ± 15.1
Таблица 2. Динамика прикрепления к корням проростков пшеницы клеток А. Ъгаяйете
Штамм A. brasilense
Количество КОЕ х 106 в гомогенате корней одного растени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.