МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 1, с. 96-107
= ИММУНОБИОТЕХНОЛОГИЯ =
УДК 577.2:083.3
КОМБИНАТОРНЫЕ БИБЛИОТЕКИ ФАГОВЫХ АНТИТЕЛ: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ АНАЛИЗА ГЕННЫХ СЕГМЕНТОВ, КОДИРУЮЩИХ ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ АУТОАНТИТЕЛ К ФАКТОРУ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ © 2011 г. М. А. Вихрова, В. В. Морозова, Я. А. Хлусевич, Н. В. Тикунова*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию и принята к печати 27.09.2010 г.
Из неиммунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека методом аффинной селекции отобраны 20 уникальных фаговых антител, направленных к фактору некроза опухолей альфа человека. Анализ генных сегментов, кодирующих отобранные антитела, показал, что репертуар вариабельных доменов тяжелых и легких цепей включает вариабельные домены как первичных наивных аутоантител, так и антител, образованных в результате соматического гипермутагенеза.
Ключевые слова: комбинаторные фаговые библиотеки, одноцепочечные антитела человека, вариабельные домены иммуноглобулинов, фактор некроза опухолей, гены зародышевых линий.
COMBINATORIAL LIBRARIES OF PHAGE ANTIBODIES: APPLICATION FOR ANALYSIS OF GENE SEGMENTS ENCODING VARIABLE DOMAINS OF AUTOANTIBODIES TO TUMOR NECROSIS FACTOR, by M. A. Vikhrova, V. V. Morozova, Ya. A. Khlusevich, N. V. Tikunova* (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Division, Russian Academy of Science, Novosibirsk, 630090 Russia; *e-mail: niboch@niboch.nsc.ru). Twenty unique phage antibodies to human tumor necrosis factor alpha were selected from a naive combinatorial library of human single chain fragment variable. Analysis of gene segments encoding selected antibodies shown that repertoire of variable domains of heavy and light chains included variable domains of both naive autoantibodies and antibodies produced as a result of somatic hypermutagenesis.
Keywords: phage display libraries, human single chain antibodies, variable domains of immunoglobulins, human tumor necrosis factor alpha, germline genes.
В последние десятилетия сформировалось новое направление, получившее название "инженерия антител". Цель этого направления — создание на основе генов, кодирующих иммуноглобулины, рекомби-нантных антител с заданными свойствами, в том числе и антител, не встречающихся в природе. Одним из способов получения рекомбинантных антител является отбор их генов из комбинаторных библиотек с использованием технологии фагового дисплея. Такая технология позволяет получать мини-антитела, как правило, в виде одноцепочечных антител (single chain variable fragment — scFv) или Fab-фрагментов, причем такие мини-антитела могут обладать не только достаточно высокой аффинностью,
но и биологическими, в частности, противовирусными свойствами. В дальнейшем, на основе вариабельных доменов отобранных мини-антител могут быть сконструированы полноразмерные антитела путем присоединения генов, кодирующих константные домены иммуноглобулинов к генам, кодирующим отобранные вариабельные домены.
Методология фагового дисплея основана на экспериментах Смита (Smith) [1], показавшего возможность экспонировать фрагмент эндонуклеазы рестрикции EcoRI на поверхности нитчатого бактериофага М13 в результате встройки гена, кодирующего этот фрагмент, в единую рамку трансляции с минорным белком оболочки p3 фага М13.
Приятые сокращения: ИЛ-18 — интерлейкин 18; ИФА — иммуноферментный анализ; ИФН-а — а-интерферон; ИФН-у — у-интерферон; ФНО-а — фактор некроза опухолей x; CDR (Complementary Determining Regions) — гипервариабельный регион; FR (Framework Region) — каркасный регион; Vh — вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина; VI — вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина; scFv (single chain Variable Fragment) — одноцепочечный вариабельный фрагмент.
* Эл. почта: tikunova@niboch.nsc.ru
p8
ДНК
фага
scFV' ген
p3
scFv
Элюция фаговых антител
Следующий раунд
Рис. 1. Схематическое изображение фагового антитела (а) и процедуры аффинного обогащения комбинаторной фаговой библиотеки (б) [8].
а
При этом поликлональные антитела к эндонуклеазе EcoRI специфически связывались с бактериофагами, в капсидах которых присутствовал химерный белок EcoRI-pIII. Кроме того, из смеси бактериофагов дикого типа и бактериофагов с рекомбинантной вставкой были отобраны бактериофаги со вставкой при использовании метода аффинного обогащения и эндонуклеазы EcoRI в качестве антигена. Для описания метода экспонирования чужеродных олиго- и полипептидов в составе поверхностных белков жизнеспособных нитчатых фагов Смит предложил термин "фаговый дисплей" (phage display). Кроме того, была разработана методика аффинного обогащения, позволяющая отбирать из фаговой библиотеки бактериофаги со встроенными последовательностями, которые имеют сродство к определенным ли-гандам. Для этой методики предложен термин "био-паннинг" (biopanning) [2].
В 90-х годах прошлого века метод фагового дисплея использовали для экспонирования антиген-связывающих фрагментов иммуноглобулинов на поверхности нитчатого бактериофага fd [3], являющегося близким родственником фага М13 [4, 5]. В
результате появился новый комбинаторный подход к созданию рекомбинантных антител, являющийся альтернативным традиционной гибридомной технологии. При использовании фагового дисплея все этапы работы, после иммунизации животных и удаления селезенки, заменяются простыми процедурами манипулирования ДНК и бактериями, что сокращает время получения стабильных клонов, синтезирующих антитела, с месяцев до недель и удешевляет этот процесс.
Преимущество фагового дисплея основано, в первую очередь, на структурных особенностях так называемых фаговых антител — нитчатых бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности в составе химерного белка с капсидным фаговым белком р3 уникальное мини-антитело. Это может быть РаЪ-фрагмент или одноцепочечное антитело, которое состоит из вариабельных доменов тяжелой (УЬ) и легкой (VI) цепей иммуноглобулина, объединенных гибким пептидным линкером (рис. 1а). При этом ген, кодирующий экспонированное мини-антитело, присутствует в геноме бактериофага,
что физически объединяет фрагменты отбираемых антител и кодирующих их генов [6—8].
Популяция фаговых антител, т.е. фаговых частиц, каждая из которых экспонирует на своей поверхности уникальное мини-антитело, составляет так называемую комбинаторную библиотеку антител. Размеры комбинаторных библиотек мини-антител могут составлять от 106 до 1012 индивидуальных клонов [7—8]. Для создания библиотеки набор амплифицированных с помощью полимеразной цепной реакции ДНК-фрагментов, кодирующих одноцепочечные антитела или Fab-фрагменты из различных источников, встраивают в фагмиду в единую рамку трансляции с геном, кодирующим белок р3. При этом образуется репертуар фагмид, каждая из которых содержит ДНК-фрагмент, кодирующий индивидуальный антиген-связывающий домен. После трансфекции в клетки Escherichia coli этого набора фагмид получают библиотеку бактериофагов, каждый из которых экспонирует на поверхности индивидуальную комбинацию вариабельных доменов тяжелых и легких цепей.
Характеристика таких библиотек зависит от уровня аффинности получаемых антител, размера библиотеки и ее функционального размера. Аффинность отбираемых антител определяется преимущественно размером библиотеки, который часто ограничен степенью эффективности этапа трансфекции клеток E. coli [9]. Размер библиотеки — это количество клонов E. coli, выросших после трансфекции клеток всей популяцией фагмид. Более важный параметр — это функциональный размер библиотеки, который определяется количеством клонов, содержащих корректно собранные гены, без делеций, сдвигов рамки считывания и стоп-кодонов. Очевидно, функциональный размер библиотеки всегда несколько ниже исходного, но именно он определяет свойства отбираемых антител [10].
В зависимости от репертуара генов, кодирующих антитела, содержащиеся в библиотеке, их подразделяют на натуральные и синтетические. Натуральные библиотеки конструируют на основе мРНК, кодирующей иммуноглобулины и выделенной из периферических лимфоцитов, костного мозга или селезенки [10—13]. Натуральные библиотеки антител делятся на "иммунные" (immune) и "наивные" (naïve). Иммунные библиотеки, сконструированные на основе мРНК периферических лимфоцитов людей, иммунизированных каким-либо антигеном, представляют большой интерес для медицинских исследований, так как в этом случае есть вероятность отобрать антитела, перспективные для терапии [14— 17]. "Наивные" библиотеки, созданные на основе мРНК лимфоцитов неиммунизированных здоровых людей, используют для получения антител, специ-
фически направленных ко множеству антигенов, в том числе и к аутоантигенам [10—12, 18]. Обычно "наивные" библиотеки, в большей степени, представляют исходный репертуар антител. Так называемые синтетические библиотеки разработаны для повышения разнообразия, размера и улучшения свойств отбираемых антител. Эти библиотеки конструируют на основе базового гена, в котором с помощью мутагенеза изменяют либо все гипервариабельные (CDR) районы [19], либо только третий гипервариабельные район Vh-домена [20, 21]. При этом разнообразие зависит только от вырожденности синтетической ДНК, используемой для изменения последовательностей CDR-петель. Кроме того, синтетические библиотеки антител конструируют на основе множества базовых V-генов, что дополнительно повышает разнообразие репертуара содержащихся в ней антител [22].
Для отбора из комбинаторных библиотек специфических антител проводят процедуру биопаннинга — аффинного обогащения библиотеки антителами, направленными к целевому антигену (рис. 1б). Для этого иммобилизованный антиген инкубируют с фаговой библиотекой, затем несвя-завшиеся фаговые антитела удаляют, а связавшиеся элюируют и используют для инфицирования клеток E. coli. Наработанные в E. coli бактериофаги выделяют и используют для следующего раунда биопаннинга. Впоследствии обогащенную библиотеку используют для отбора индивидуальных антител, направленных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.