ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 462, № 2, с. 230-232
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 612.822.3
КОМЕНОВАЯ КИСЛОТА СНИЖАЕТ ЧАСТОТУ ПОВТОРНЫХ ОТВЕТОВ МЕМБРАНЫ НОЦИЦЕПТИВНОГО НЕЙРОНА
© 2015 г. О. Е. Дик, Т. Н. Шелых, В. Б. Плахова, академик РАН А. Д. Ноздрачев, Б. В. Крылов
Поступило 14.07.2014 г.
БО1: 10.7868/8086956521514025Х
Работа посвящена выяснению возможной физиологической роли активационной воротной структуры медленного натриевого канала NaV1.8 в импульсном кодировании ноцицептивной информации. Регистрация трансмембранных ионных токов через медленные тетродотоксиннечув-ствительные натриевые каналы NaV1.8 методом локальной фиксации потенциала и математическое моделирование мембраны ноцицептивного нейрона, учитывающее вклад этих каналов в генерацию импульсной активности, позволили показать снижение возбудимости мембраны только за счет модуляции потенциалзависимых характеристик активационного воротного устройства. Эти изменения, приводящие к уменьшению величины эффективного заряда, переносимого через мембрану ноцицептивного нейрона при открывании активационного устройства каналов NaV1.8, описывают специфическое воздействие коменовой кислоты (5-гидрокси-у-пирон-2-кар-боновой кислоты), являющейся лекарственной субстанцией нового отечественного анальгетика, отличающегося совершенно безопасным механизмом действия и сильным обезболивающим эффектом [1].
Таким образом, результаты нашего исследования объясняют молекулярный механизм анальге-тического действия коменовой кислоты.
Эксперименты выполнены на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев крыс популяции Wistar с использованием методики, которая подробно описана ранее [2]. Интактные клетки, полученные после 2 ч культивирования в стандартных питательных средах, переносили в экспериментальную камеру, перфу-зируемую наружным раствором. В работе использовали реактивы фирмы "Sigma" (США). Трансмембранные ионные токи INas(E,t) через медлен-
Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской Академии наук, Санкт-Петербург E-mail: krylov@infran.ru; verapl@maul.ru
ные тетродотоксиннечувствительные натриевые каналы ^ау1.8 [3] регистрировали методом локальной фиксации потенциала в условиях плотного контакта в конфигурации регистрации активности целой клетки [4].
Потенциалозависимые константы скоростей переходов воротных структур медленных натриевых каналов определяли многопараметрическим методом наименьших квадратов. Минимизацию функционала осуществляли методом градиентного спуска. В контрольных условиях эти зависимости для активационной воротной системы были определены как
ГТЛ — аЕ+Ь1 — 0.043Е-2.22
а АЕ) =е =е ,
в (Е) = еа2Е+Ь2 = е-0.048Е-4.33
а после применения коменовой кислоты в концентрации 100 нмоль/л приобретали вид
0.047Е-2.71 0 /гч -0.025Е-3.65
а, (Е) = е , р^ (Е) = е ,
что соответствовало уменьшению эффективного заряда, переносимого через мембрану ноцицеп-тивного нейрона при открывании активационно-го воротного устройства каналов ^ау1.8. Это уменьшение происходило в пределах от значения Zeff = 6.9, полученного в контрольных опытах, до величины Zeff = 5.5 после воздействия коменовой кислоты. Эффективный заряд (в единицах заряда электрона) рассчитывали по формуле
= а - а2),
е
полученной по методу Алмерса [5], где е — заряд электрона, к — постоянная Больцмана, Т — абсолютная температура, соответствующая 22°С, коэффициент 3 учитывает, что поведение активаци-онного воротного устройства натриевых каналов соответствует трехбарьерной модели.
Единственным методом, позволяющим выяснить физиологическую роль специфической модификации активационного воротного устройства натриевого канала, ведущего к снижению Zeff, является метод математического моделирова-
КОМЕНОВАЯ КИСЛОТА СНИЖАЕТ ЧАСТОТУ ПОВТОРНЫХ ОТВЕТОВ
231
ния. В связи с тем, что основной вклад в генерацию импульсной активности ноцицептивного нейрона млекопитающих при воздействии стимулирующего тока (I) вносят быстрый тетродо-токсинчувствительный натриевый (1Ш) медленный тетродотоксинустойчивый натриевый (/д^), задержанный калиевый (1К) ток и ток утечки (IL), модель мембраны ноцицептивного нейрона описывалась системой уравнений:
^ = (I - 1т (т, И, Е) - 1К (п, Е) -м
-1ь(Е) - 1*0,& Г, Е))/Ст, — = (х^(Е) - х)/тХ(Е), х = т, И, п,,, г,
м
1*0/ = 8т/тЪИ(Е - Еш), (1)
1к(п, Е) = gкn\Е - Ек), Ь(Е) = ^^(Е - Е£),
1*0,(,, Г, Е) = gN0Ss3Г(Е - Е*о), где Е — мембранный потенциал, т, Н, п, г — переменные, описывающие активационные и инак-тивационные воротные процессы, ст = 5 пФ — емкость мембраны, gNaf = 25 нСм, gк = 20 нСм, gL= 2.5 нСм — максимальные проводимости, ЕДа = 60 мВ, Ек = —75 мВ, ЕL = —55 мВ — равновесные потенциалы. Потенциалзависимые характеристики воротных устройств каналов задавались функциями
хх(Е) =
а х (Е)
а х (Е) + в х (Е)
т х(Е) =
1
а х (Е) + в х (Е)
х = т, И, п,,, г,
а т(Е) =
0.115(1 + еЕ+70)/10)
1 + е
вт(Е) = 0.115(1 + е +25)/8),
(Е+40)/42 -(Е+25)/8ч
а И(Е) = 0.012(1 + е
-(Е+43)/10
в и(Е) =
1.32
1 + 0.2е -(Е+10)/7'
а п(Е) =
0.13(Е + 45) 1 - е
в п(Е) = 0.13е
-(Е+45)/12 ' -(Е +45)/30
где х„ — стационарное значение переменной активации или инактивации соответствующей популяции ионных каналов, тх — постоянная времени этих процессов; ах и рх для 1даш имели общий
вид а х (Е) = еа'Е+ь', р х (Е) = еа'Е+ь', где коэффициенты были подобраны таким образом, чтобы обеспечить наилучшее соответствие с данными, полученными экспериментально в режиме фиксации потенциала. Константы скоростей для других типов каналов были взяты из литературных данных [6, 7]:
30 40 50 60 Стимулирующий ток, пА
Рис. 1. Область периодических ответов модели мембраны ноцицептивного нейрона. Плоскость (2^, I) построена при значении gNas = 20 нСм.
Для построения границы области, в которой происходит генерация периодической импульсной активности, применяли метод бифуркационного анализа [8]. Эта граница разделяет множество значений параметров модели на те, при которых наблюдается периодическая импульсация, и значения, при которых колебания отсутствуют или являются затухающими.
На рис. 1, на плоскости (2ей-, I), представлена граница области, внутри которой существуют устойчивые периодические колебания, возникающие в результате бифуркации Андронова—Хопфа. Потеря устойчивости стационарного состояния системы происходит скачком в виде "жесткого" возбуждения, приводящего к возникновению колебаний потенциала большой амплитуды. Эта граница построена при значении gNaS = 20 нСм. Повторные ответы ноцицептивного нейрона наблюдаются при значениях стимулирующего тока, находящегося в диапазоне 6 пА < I < 58 пА, и отсутствуют при значениях > 7.5. В контрольных условиях (при 2е(Г = 6.9) ритмическая активность мембраны возможна в пределах от 6 до 38 пА. После снижения величины эффективного заряда область расширяется, и при значении 2е(Г = 5.5 повторные ответы возможны в интервале стимулирующих токов от 10 до 54 пА. При этом за пределами построенной границы мембрана но-цицептивного нейрона отвечает на внешний стимул, как правило, только одиночным потенциалом действия.
Численное интегрирование уравнений системы (1) при значениях параметров, соответствующих области периодических решений, показало, что при постоянном значении проводимости и
232
ДИК и др.
E, мВ 20 0 -20 -40 -60
20 0 -20 -40 -60
0
0
300
300 t, мс
Рис. 2. Уменьшение частоты периодических ответов модели мембраны ноцицептивного нейрона при воздействии коменовой кислоты. а — импульсная активность мембраны рассчитана в контрольных условиях (Zeff = 6.9); б — повторные ответы после воздействия коменовой кислоты (Zeff = 5.5). Величина стимулирующего тока соответствовала I = 12 пА, gNaS= 20 нСм-
уменьшении Zeff частота периодических ответов падает (рис. 2), что свидетельствует о снижении возбудимости мембраны ноцицептивного нейрона. Это изменение импульсации получено при изменении величины эффективного заряда, имитирующего специфическое воздействие коменовой кислоты, изменяющее потенциалзависимость констант скоростей переходов.
Таким образом, наши результаты объясняют антиноцицептивный эффект коменовой кислоты. При этом важно отметить, что указанная важнейшая физиологическая функция не блокируется полностью, а лишь модифицируется. Известно, что высокочастотная составляющая импульсного ответа ноцицепторов несет собственно "болевую" информацию [9], т.е. увеличение частоты ответов ноцицептивных нейронов связано с возникновением боли, а уменьшение этой частоты на фоне сохранения импульсации свидетельствует о выключении составляющей, которая кодирует но-цицептивную компоненту в импульсном ответе. Полученные с помощью наших расчетов данные о том, что вызванное применением коменовой кислоты специфическое снижение величины эффективного заряда Zeff активационной воротной структуры медленных натриевых каналов приводит к уменьшению частоты повторных ответов, а не к полной блокаде импульсации, свидетельствует в пользу высокой специфичности анальге-тической активности данной субстанции. Этим
также можно объяснить отсутствие негативных побочных эффектов при ее применении.
В заключение отметим, что новый отечественный неопиоидный анальгетик "Аноцептин", активной фармацевтической субстанцией которого является коменовая кислота, успешно прошел первую фазу клинических испытаний.
Работа поддержана грантом РНФ № 14—15— 00677.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Krylov B.V., Plakhova V.B., Rogachevsky I.V. Substance with Sedative Effect. Pat. № US 8,476,314 B2. Date of Patent July 2, 2013.
2. Yachnev I.L., Plakhova V.B., Podzorova S.A., et al. // Med. Chem. 2012. V. 8. № 1. P. 14-21.
3. Goldin A.L. // J. Exper. Biol. 2001. V 205. P. 575-584.
4. Hamill O.P., Marty A., Neher E. // Pflug. Arch. 1981. V. 391. № 1. P. 85-100.
5. Алмерс В. Воротные токи и движение зарядов в возбудимых мембранах. В кн.: Мембраны: ионные каналы. М.: Мир, 1981. С. 129-236.
6. Chevrier P., Vijayaragavan K., Chahine M. // Brit. J. Pharmacol. 2004. V. 33. № 3. P. 576-584.
7. Read H.L., Siegel R.M. // Neuroscience. 1996. V. 75. № 1. P. 301-314.
8. Kuznetsov Y.A. Elements of Applie
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.