БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.5, с.826-835
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.352.2
КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ ГОЛОТУР ИЙ С ХОЛЕСТЕР ИНОМ КАК О СНОВА ЛИПИД-САПОНИНОВЫХ НОСИТЕЛЕЙ СУБЪЕДИНИЧНЫХ
АНТИГЕНОВ
© 2008 г. А.Н. Мазейка*, А.М. Попов, В.И. Калинин, С.А. Авилов, А.С. Сильченко, Э.Я. Костецкий*
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022, Владивосток,
пр. 100-лет Владивостоку, 159;
Дальневосточный государственный университет, 690000, Владивосток, ул. Октябрьская, 27
Поступила в p едакцию 23.11.07 г.
Поме доpаботки 30.04.08 г.
Исследована cnoco6Hocrb Tp^repпеновых гликозидов голотуpий: KyKyMapиозида А2-2 из Си-систапа ]аротса, кyкyмаpиозида G1 из Сиситапа fraudatrix, фpондозида А из Сиситапа frondosa и голотоксина А1 из Аро^ИсИорш ]аротсш к фоpмиpованию надмолекyляpныx ли-пид-сапониновых комплектов. C помощью пpоcвечивающей электpонной ми^оcкопии установлено, что вcе исследованные cоединения обpазyют в водной cpеде надмолекyляpные xолеcтеpин-cапониновые комплексы, npедcтавляющие cобой наночастицы. Комплексы, фоp-миpyемые кyкyмаpиозидом А2-2, голотокcином А1 и фpондозидом А, имеют тyбyляpный тип crp оения и пpинципиально отличаются от типа cтp оения частиц, фоpмиpyемыx кyкyмаp иозидом G1. Моpфология наночаcтиц, фоpмиpyемыx кyкyмаpиозидом А2-2, голотокcином А1 и куку-маpиозидом G1 менялаcь в завиcимоcти от доли xолеcтеpина в липид-cапониновой cиcтеме, тогда как пpи фоp миp овании чаcтиц фp ондозидом А такой завиcимоcти не обнаpyжено. П pи одинаковой моляpной доле xолеcтеpина в липид-сапониновой cиcтеме кyкyмаpиозид А2-2 фоpмиpовал частицы наиболее вьф аженного тyбyляp ного строения, менее вьфаженное тpyб -чатое строение наблюдалось у xолеcтеpин-cапониновыx комплекcов голотокcина А1, в то вpемя как cтpyктypа чаcтиц, cфоpмиpованныx фpондозидом А, оказалаcь кp айне гетеpогенна. Cpавнительный анализ моpфологии описанных надмолекyляpныx комплекcов и оcобенноcтей c^y^yp ы гликозидов показал, что cyпеpcтpyктyp а фоp миpyемыx ими наночастиц завиcит от cтепени pазветвленности углеводной чаcти молекулы гликозида, а фоpмиpование комплекcа c xолеcтеpином опpеделяетcя особенностями cтpоения агликона. Таким обpазом, доказана возможноcть фоpмиpования нового поколения носителей антигенов на остове опиcанныx комплекcов.
Ключевые слова: тритерпеновые гликозиды, липид-сапониновые комплексы, стерины, носители антигенов, вакцины, наночастицы.
В настоящее вpемя известен широкий кр уг приpодных веществ, обладающиx мембpано-тp опной активностью. В эту гр уппу вxодят соединения веcьма pазнообpазного xимичеcкого cтpоения: белковые поpофоpмиpующие токсины [1], полиеновые антибиотики [2], стероидные и тpитеp пеноидные гликозиды [3], а также гли-коалкалоиды [4]. П pиpодные мембpанотpопные cоединения обладают широким cпектpом био-логичеcкой активности: выполняют защитные и pегулято pные функции, являютcя инструмен-
Cокpащения: КДА - кyкyмаpиозид А2-2, Хл - холем^ми, ПЭМ - пpоcвечивающая электpонная микpоcкопия.
том агр ессии и борьбы за жизненное пр остран-ство организма-продуцента [1,5].
Биологическая активность данных веществ обусловлена их способностью связываться с ли-пидным бислоем и изменять функциональные свойства плазматической мембраны [6]. При этом для всех природных мембранотропных соединений в той или иной мере ха р актер но селективное связывание с отдельными компонентами липидного бислоя. Одним из важнейших компонентов плазматических мембран эу-кар иотических клеток являются стер ины, которые оказывают влияние на жидкостно-кристал-лическое состояние липидного бислоя, распределение мембранных белковых доменов и барьерные свойства мембраны [7]. Селективное свя-
зывание c мембранными стеринами лежит в основе молекулярного механизма действия многих природных мембр аноактивных токсинов, и особенно типично для сапонинов.
Тритерпеновые гликозиды голотурий считаются одними из самых активных мембр ано-тр опных соединений ср еди сапонинов. Показано, что кукумариозид А2-2 (КДА) и кукума-риозид G1; фрондозид А, голотоксин А! обладают мощным гемолитическим действием, связанным с их способностью селективно и с высоким аффинитетом формировать стерин-гли-козидные комплексы [8,9]. Вместе с тем в очень низких дозах (0,001 - 0,01 мкг/мл) данные тр и-терпеновые гликозиды обладают выраженной иммуностимулирующей активностью. Так, кукумариозид А2-2 в малых дозах повышает неспецифическую устойчивость к бактер иальным [10] и вирусным инфекциям [11], а голотоксин А1 проявляет иммуноадъювантные свойства [12]. Аналогичными свойствами обладают тр и-тер пеновые сапонины из коры квиляйи мыльной (мыльного дерева) Quillaja saponaria (Quil A) — структурообразующие компоненты иммуностимулирующих комплексов. Эти стабильные комплексы, состоящие из холестерина (Хл), фосфолипида и сапонина, представляют собой пер фор ир ованную р игидную сферическую везикулу диаметр ом около 40 нм. В настоящее время такой надмолекулярный липид-сапони-новый комплекс широко используется для встраивания бактериальных, вирусных и опухолевых антигенов, что позволяет значительно увеличивать их иммуногенность и протектив-ность [13]. Однако клиническое пр именение иммуностимулирующих комплексов затруднено из-за плохой стандартизации смеси сапонинов из Quillaja saponaria, входящих в их состав [13,14].
Надмолекулярные комплексы сходного типа могут быть образованы на основе других соединений, в частности тритерпеновых гликози-дов голотурий. При этом важно подчеркнуть, что процесс связывания большинства тритер-пеновых гликозидов с холестерином, основным стер ином клеток млекопитающих, вероятно, необратим и характеризуется большим аффинитетом [8,9]. Отсюда понятен наш интерес к комплексам тритерпеновых гликозидов голотурий с холестерином.
В настоящей работе проведена ср авнитель-ная оценка морфологии липид-гликозидных комплексов четырех индивидуальных морских гликозидов с холестерином с целью последующего выбора оптимального носителя для субъединичных вакцин.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
И сследовали комплексообразующую способность тр итерпеновых гликозидов голотурий голостанового ряда: кукумариозида А 2-2 из Cu-cumaria japonica, полученного в соответствии с методиками [15] (метод о саждения из бутанола) и [16] (хр оматографический метод), фрондозида А из Cucumaria frondosa [17], кукумариозида Gi из Eupentacta (seu Cucumaria) fraudatrix [18] и голо токсина А1 из Apostichopus japonicus [19]. Также был использован коммерческий препарат холестерина (Sigma, США).
Надмолекулярные холестерин-сапониновые комплексы получали методом гидратации ли-пидных пленок [20]. Для этого необходимое количество раствора холестерина в хлороформе (5 мг/мл) вносили в круглодонную колбу и с помощью роторного испарителя удаляли органический растворитель. Полученную после удаления растворителя холестериновую пленку со-любилизировали заранее рассчитанным количеством раствора тритерпенового гликозида в дистиллированной воде (4 мг/мл). Затем, добавляя 0,01 М фосфатно-солевой буфер рН 7,2, доводили концентрацию холестерина в суспензии до 0,5 - 1 мг/мл. Полученную суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин, при 22 кГц, с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН -2Т (Ро ссия).
Морфологию надмолекулярных холестерин-сапониновых комплексов исследовали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Препараты холестерин-сапониновых комплексов наносили на формваровую подложку, укрепленную на никелевых сетках. И споль-зовали негативное контрастирование 2% водным раствором фосфорно-вольфрамовокислого калия, рН 7,2. Исследование образцов и фотографирование проводили на просвечивающем электронном микр оскопе JEM-100S (Jeol, Япония), при ускоряющем напряжении 80 кВ. Возникавший астигматизм компенсир овали настройками инструмента. Увеличение микроскопа тестировали по диаметру микротрубочек центриолей клеток на гистологическом препарате. Полученные негативы оцифровывали с помощью сканера, используя программу Ргесь sion Scan Рго (формат tif с разрешением 1600 точек на дюйм).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
И сходя из подобия химической структуры сапонинов Quil A, гликоалкалоидов растений семейства пасленовые и тритерпеновых глико-зидов голотурий, а также учитывая способность этих соединений обр азовывать комплексы с хо-
(а)
(он
но
он
Рис. 1. Структурные формулы тритерпеновых гликозидов голотурий: кукумариозида А2-2 (а); кукумариозида О] (б); фрондозида А (в), голотоксина А] (г) [5].
лестерином биомембран, мы предположили, что тр итер пеновые гликозиды голотур ий способны фор мир овать надмолекуляр ные комплексы с холестерином, аналогичные комплексам РиН А и гликоалкалоидов.
Для изучения возможности образования надмолекулярных холестерин-сапониновых
комплексов тритерпеновых гликозидов голотурий были исследованы холестерин-сапониновые системы на основе четырех различных гликозидов: кукумариозида А2-2, голотоксина А1; фрондозида А и кукумариозида О] (рис. 1). Морфологический анализ частиц, полученных холестерин-сапониновых суспензий проводили
Рис. 2. Электронные микрофотографии надмолекулярных холестерин-сапониновых комплексов, обнаруженных в системах КДА-Хл при различных молярных соотношениях компонентов: (а) - (1:1); (б) - (1:3); (в) - (1:6); (г) - (1:9). Масштабная линия соответствует 100 нм.
методом ПЭМ, используя негативное контрастирование раствором фосфорно-вольфрамово-кислого калия.
Было установлено, что все исследованные тр итерпеновые гликозиды обладают способностью фор мировать надмолекулярные комплексы с холестерином (р ис. 2 - 6). Однако частицы холестерин-сапониновых комплексов, образуемые каждым соединением, оказались принципиально отличны по своим морфологическим характеристикам, а следовательно, и по молекулярной о рганизации.
Из трех исследованных тритерпеновых гли-козидов только кукумар иозид А2-2, полученный хр оматогр афическим методом (ХрКДА), оказал-
ся способным формировать надмолекулярные холестерин-сапониновые комплексы, частицы которых имеют четко выраженное тубулярное стр оение и несут канал в центр е. На формирование частиц надмолекулярных компл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.